法国oxxius激光器在光流控流式细胞术中的应用

随着人类社会现代化高速发展，由于各种原因导致的癌症已经成为严重危害健康的头号杀手，下图为2018年统计数据。因此对癌细胞的早期筛查和前期诊断是保障患者生命安全的重要手段，现在常用的组织活检存在取样困难，代表性差以及并发症高的风险，而影像学和血清检测又不够灵敏。于是，基于循环肿瘤细胞（CTCs）液体活检的光流控流式细胞术由于分子信息全面、采样方便、侵入小、无放射性污染、成本低等优点成为了最具潜力的检测手段。下面小编就来带你了解一下光流控流式细胞术。

 

 

首先，什么是CTCs?

循环肿瘤细胞这一概念于1869年阿什沃斯医生提出，通俗的讲这一概念指的是肿瘤细胞从肿瘤母体脱离并以体液（一般为外周血）为传播手段进行转移扩散，其中部分肿瘤细胞可能会在此过程中凋亡，但也有部分肿瘤细胞存活成为恶性肿瘤，导致患者死亡，转移过程如下图。

 

 

然后，什么是CTCs检测？

CTCs检测技术大致包括密度梯度离心法、过滤法、免疫磁性分离、Cell Collectors、流式细胞检测技术这几种。我将简单介绍这几种。密度梯度离心法利用肿瘤细胞和红细胞密度不同的特点采用离心分离将肿瘤细胞置于分离液上层，虽然操作简单但是对血液样品质量要求高且准确性也不理想。过滤法采用直径很小的滤膜将肿瘤细胞滞留分离，虽然不依赖于细胞特异性标记但是也存在漏检的风险。免疫磁性分离是以含有特异性抗体的磁珠与含有表面特异性抗原的肿瘤细胞结合，在磁场的作用下与磁珠结合的肿瘤细胞被暂时吸引，从而与其他细胞分离，而达到特异性分离，分离效果很好但极度依赖特异性抗原。Cell Collectors是利用功能结构针插入病人静脉30分钟进行CTCs分离，针上带有抗体可以识别分离肿瘤细胞表面抗原，但是此方法具有侵入性。然后是流式细胞术，流式细胞术可对经荧光染色或标记的肿瘤细胞进行测量和筛选，此方式常用的工具为流式细胞仪，但传统的流式细胞仪由于对精度的要求导致测试的时间长达24小时甚至更久，因此科学家们提出了一种改进的方式，即为光流控流式细胞术的技术，此技术分为光流控和流式细胞术两部分。
什么是光流控技术？
光流控作为一项将光学与微流控芯片相结合的新技术，可以将细胞操纵和光学检测等过程集合在一块芯片上完成，是一种细胞学实验技术。2019年 巴沙尔·哈姆扎等人首先将光流控系统应用于实验，以30ml/min的速度从小鼠体内抽取血液并利用微流控芯片对血液中CTCs进行检测与筛选。能够较为快速地检测分离出CTCs，并可将得到的CTCs进行后续分析。效果如下图。

 

 

尽管这一技术较之传统CTCs检测有着巨大优势，但是由于微流控芯片自身功能限制的原因使得此技术只能获取部分CTCs从而导致无法分析肿瘤细胞集群间差异，而且此技术过程复杂，对于光学部分也有着较高要求。

对于前者我们只能要求微流控芯片的设计和制作能够精益求精，技术过程复杂可通过合理的规划施予减轻，这里我们主要谈谈光流控流式细胞术的光学检测模块。山东师范大学研究团队们搭建了一种高效的光学模块，光学检测模块是对CTCs进行灵敏性高、取样参数多、实时高通量单细胞表征与分型计数检测细胞荧光信息的识别及特征分析、检测结果的统计与分析。在该检测模块中，488nm和638nm双波长激光器（L6C-488/638-150-023，法国Oxxius公司）发出的合束激光（如果觉得双激光器光路搭建繁琐，也可使用法国oxxius公司多波长合束激光器）通过扩束准直组件、全反射镜M1、多截止波长二向色镜MDM和反射镜M2后形成平行光束进入镜物OB（20x，NA为0.42），由物镜OB聚焦到焦平面上，在距离十字交叉口下方3mm处的检测通道中心形成一个直径约20μm的近圆形检测区域，以激发流经检测区域的细胞产生荧光和散射光。检测区域的荧光被同一物镜收集后形成平行光束透过全反射镜M2反射和多边缘分色分光器（透射率>93%）透过后，到达分光镜 DM1（透射率>95%），因此物镜收集到的荧光约90% x 93%≈86%进入荧光检测通道。被多边缘分色分光器透射的荧中，绿色荧光被二色分光镜DM1反射至荧光检测通道1（APD1），透过二色分光镜DM1的黄色荧光被DM2反射至荧光检测通道2（APD2），透过DM2红色荧光则被二色分光镜DM3反射至荧光检测通道3（APD3），而透过DM3的近红外荧光则被投射到荧光检测通道4（APD4）。绿色荧光检测通道入口处放置了滤光片F1，只有波长范围510–530nm之间的光可以通过；黄色荧光检测通道入口处放置了滤光片F1，只有波长范围在560–590nm之间的光可以通过；红色荧光检测通道入口出放置了滤光片F3，只有波长范围在650-690nm的光可以通过；近红外荧光检测通道入口出放置了滤光片F4，只有波长范围在700-740nm的光可以通过。滤光片可以过滤掉绝大部分杂散光；而位于针孔（P1-4）前150mm处的透镜AL1-3将原来的平行光线汇聚到针孔处,消除了非共焦位置产生的荧光等。紧贴着针孔（P1-4）处放置了单光子计数的雪崩光电二极管模块APD，这样可以非常灵敏地将接收到的荧光转换成电压信号。如下图。

 

   

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