采用相干公司 AXON 780 光纤激光器的双光子代谢 FLIM

图 1：Coherent Axon 780 飞秒激光器

Becker & Hickl GmbH 是光子计数设备的技术领导者，早些时候已经表明，小型飞秒光纤激光器可用作多光子荧光成像系统的廉价激发源。激光器的发射波长为 780 nm，脉冲频率为 40 MHz 至 80 MHz，平均功率为 100 mW 至 500 mW，不仅适用于激发 NAD(P)H，还适用于各种其他荧光团，包括荧光寿命极短的荧光团。

因此，Becker & Hickl 有兴趣了解 Axon 飞秒光纤激光器在这些应用中的性能。

“我们已经证明，相干公司 Axon 780 飞秒光纤激光器与 bh 的精确扫描仪光学元件器件、探测器、TCSPC / FLIM 电子器件和数据分析软件相结合，可提供有关活细胞和组织代谢的准确信息。”– Wolfgang Becker，德国柏林 Becker & Hickl GmbH 总经理

系统架构

作为测试系统，他们使用 bh DCS-120 MP 多光子 FLIM 系统。该系统的架构如图 2 所示。

图 2：多光子激光扫描 FLIM 系统原理

Axon 780 激光器的激光器激光束通过自由光束注入 DCS-120 扫描头。在扫描头内部，它被两个快速振镜偏转。扫描头的扫描透镜将激光束投射到显微镜中。在显微镜内部，光束穿过二向色分束器，并投影到显微镜透镜的后孔上。显微镜物透镜将光束聚焦到样品内部的图像平面中。当光束被振镜偏转时，激光激光器聚焦光栅扫描会在样品中的图像区域上方进行。

为了获得最大的空间分辨率，激光束必须完全填充显微镜透镜的后孔径。对于扫描和管透镜的通常焦距，情况并非自动发生。因此，光束在进入扫描仪之前会扩展 1.5 倍。后孔中的光束直径约为 12 mm，这足以填充即使是最大的显微镜透镜的孔径。过度填充微孔是没有问题的。激发功率的相关损失是可以容忍的，因为激光器提供的功率远远超过所需的功率。

从样品中收集荧光，通过显微镜透镜返回，然后通过非去扫描光束路径馈送。L1 和 L2 形成望远镜。望远镜还收集显微镜透镜未完全准直的光子，例如散射在厚样品之外的光子。荧光被分成两个波长间隔，并通过两个 bh HPM-100-40 混合检测器进行检测。检测器的单光子脉冲记录在两个 SPC-180N TCSPC / FLIM 模块中。SPC-180N 模块确定激发脉冲后光子的检测时间和扫描仪在光子检测时的位置。此信息用于构建 FLIM 图像。这些是像素阵列，每个像素在大量时间通道中都包含完整的荧光衰减曲线。

反激相位激光束和光束消隐的扫描由 bh GVD-140 扫描控制器卡进行硬件控制。激光强度控制通过 Axon 激光器的 AOM 控制信号输入执行。该信号也由 GVD-140 卡提供。整个系统由 bh 的 SPCM 数据采集和控制软件运行，提供具有扫描仪控制、激光器控制、数据采集和数据分析功能的完全集成 FLIM 系统。FLIM 系统的用户界面如图 3 所示。

图 3：SPCM 数据采集和控制软件的主面板

结果

使用 DCS-120-AXON 组合拍摄的 FLIM 图像如图 4 至图 6 所示。所有图像均使用 40x，NA= 1.3 的油浸透镜。使用 bh SPCImage NG FLIM 数据分析套件进行数据分析。图 4 和图 5 显示了平均(振幅加权)寿命和代谢指标 a1 的颜色编码 FLIM 图像。右上方显示了所选图像参数(tm 或 a1)的直方图，右下方显示了光标位置的衰减曲线。所选光斑的衰减参数显示得非常右。

图 4：猪皮、NADH 图像、双指数衰减的振幅加权平均寿命

图 5：猪皮、NADH 图像、振幅、a1、快速衰变成分。a1 是代谢状态的指标

图 6 显示了酵母细胞。选择发射滤光片来检测 440 至 470 nm，从而将光谱范围限制为检测 NAD(P)H。 470 nm 的检测上限可能看起来非常严格。但是，为了避免检测 FAD 和 FMN 荧光，必须限制在 470 nm 以下。这些化合物与 NAD(P)H 一起被激发，但对代谢状态表现出不同的依赖性。数据通过 SPCImage NG 的 MLE 算法进行分析，在图像的各个像素中提供高精度双指数衰减参数。所示图像显示 a1，即快速衰减分量的振幅。它表示未结合 NAD(P)H 的数量。 由于结合/游离比随代谢而变化，a1 也称为“代谢指标”。

可以看出，a1 在不同细胞中明显不同。这表明不同细胞中的代谢状态不同。高 a1(显示为蓝色)表示新陈代谢更糖酵解，低 a1(黄色)表示更氧化。

图 6：酵母细胞、NADH 图像、振幅、a1、快速衰变组分、代谢状态指标

“我们已经证明，相干公司 Axon 780 飞秒光纤激光器与 bh 的精确扫描仪光学元件器件、探测器、TCSPC / FLIM 电子器件和数据分析软件相结合，可提供有关活细胞和组织代谢的准确信息。” 凭借其基于 AOM 的内部强度控制，激光器可以顺利集成到 bh 的 SPCM FLIM 采集软件中。在光束停止情况和扫描仪反激阶段以及可重现的强度控制下，光束消隐可保护样品免受局部光损伤。总而言之，DCS-120 MP / Axon 780 组合是一种易于使用的高分辨率、高灵敏度双光子激光扫描 FLIM 显微镜。


审核编辑 黄宇