荧光编码对数稀释数字PCR技术实现超宽动态范围的核酸定量

数字PCR（dPCR）技术由于其绝对定量的能力和极高的灵敏度，被广泛的应用于分子诊断领域。然而，与目前的金标准定量PCR（qPCR）相比，dPCR在动态范围上落后了3 ~ 4个数量级，这极大地限制了其在临床领域的应用。例如，对一些载量范围波动较大的病毒感染样本进行定量时，高载量的样本往往会使dPCR显全阳性而无法通过泊松分布定量。因此，亟需开发一种比目前的dPCR动态范围更大且简便易用的新的dPCR策略。

近期，上海科技大学刘一凡课题组与中科院上海微系统所、南方医科大学南方医院团队合作开发了荧光编码对数稀释数字PCR技术（Flodd-PCR），该方法展示出的动态范围为10⁷，比传统dPCR高了逾两个量级。相关研究成果以“Fluorescence-coded logarithmic-dilution digital droplet PCR for ultrawide-dynamic-range nucleic acid quantification”为题，发表在Biosensors and Bioelectronics期刊上。上海科技大学物质科学与技术学院刘一凡课题组2023届硕士毕业生施清源、2021级博士研究生李婕、南方医科大学南方医院检验科刘春辰博士为本文共同第一作者，上海科技大学刘一凡研究员、中科院微系统研究所罗源副研究员、南方医科大学南方医院郑磊教授为本文通讯作者。

Flodd-PCR基本工作原理

如图1所示，Flodd-PCR的基本原理为在一次dPCR反应中引入四种对数稀释的样本浓度，每种稀释倍数分别对应一种浓度指示剂荧光强度；在PCR后，液滴将被根据荧光强度拆分成四组，每组分别进行拷贝数定量。如此以来，一次Flodd-PCR实验约等效于四组进行梯度稀释的、平行的dPCR实验，从而大幅提高了动态范围。

为了实现上述概念，研究团队首先设计并开发了一种微流控芯片，该芯片能够实现对检测样本的连续对数梯度稀释（20 ~ 1000倍）和并行液滴生成（图2），Flodd-PCR芯片一共有两个入口，一边通入待检测的模板DNA样本和荧光指示剂，一边通入PCR所需的其他试剂：酶、引物、探针等。上述两种溶液经过连续梯度稀释后将生成4组液滴，每组的液滴内DNA模板和荧光指示剂都稀释在一个特定的浓度，同时又使其他试剂（如引物、探针和聚合酶等）保持在正常工作浓度。在热循环后，利用商业化数字PCR液滴阅读仪同时读取PCR探针荧光和稀释指示剂荧光，最终根据荧光指示剂将混合的液滴分成四个聚类，并分别计算拷贝数。

图1 Flodd-PCR原理流程图

图2 Flodd-PCR芯片设计及稀释性能表征

Flodd-PCR的动态范围表现及临床有效性验证

接下来，研究团队通过一系列实验表征了Flodd-PCR的实际动态范围，如图3所示。实验结果表明常规dPCR的动态范围仅为4 ~ 40,000拷贝/µL，而Flood-dPCR得益于连续梯度稀释的功能，能够将检测动态范围扩宽到4 ~ 20,000,000拷贝/µL。此外，团队还将Flodd-PCR和其他的代表性高动态范围dPCR方法进行了横向比较，结果表明Flodd-PCR在实现超高动态范围的同时并没有增加液滴的数量，这意味着Flodd-PCR的液滴读取和传统dPCR一样简便。

图3 Flodd-PCR的动态范围标准

最后，为了验证Flodd-PCR在临床检测上的实用性，研究团队将其应用于临床患者样本中人乳头状瘤病毒HPV（16型）的定量检测。HPV-16作为高危病毒类型可以在70%的宫颈癌病例中发现，其病毒载量的动态区间可达10⁷以上，远超出了传统dPCR的动态范围（约10⁵）。实验结果表明（图4），得益于更高的动态范围，Flodd-PCR的定量成功率优于dPCR，其定量结果也和金标准qPCR高度一致。以上结果表明，Flood-PCR技术可以运用到真实的临床案例中。

综上所述，Flodd-PCR是一种新颖的超高动态范围的数字PCR技术，其巧妙地运用了微流控技术和荧光编解码策略，实现了多种浓度样本检测的“多路复用”。此外，Flodd-PCR在操作流程上与传统数字PCR高度一致，甚至兼容商业化数字PCR设备，这使得该技术在实际推广上具有重要优势。

图4 Flodd-PCR对临床HPV样本的高动态范围定量






审核编辑：刘清