中科院长春光机所利用微流控技术研发出一体化数字PCR系统

近日，中科院长春光机所应用光学国家重点实验室利用微流控技术，将微滴生成、PCR扩增和荧光检测等环节进行集成，运用连续流动式PCR扩增方法，实现了“样本进、结果出”的一体化数字PCR系统。

数字PCR也叫Digital PCR（dPCR），是一种核酸分子绝对定量技术。相较于传统荧光定量PCR(qPCR)来说，dPCR对结果的判定不依赖于扩增曲线循环Ct值，不受扩增效率的影响，能够直接读出DNA的分子个数，是对起始样本核酸分的子绝对定量。dPCR一般包括三部分内容，即样本离散、PCR扩增和荧光信号分析。与传统技术不同，dPCR一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元。每一个反应单元独立进行PCR扩增反应。不同于qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法，dPCR技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。针对这一检测流程，提出了一种连续流动式、全自动、一体化集成数字PCR系统，只需要一次进样就可同步实现微液滴生成、热循环扩增以及核酸绝对定量分析的整个dPCR检测流程。

图1 数字PCR原理及检测过程

如图2所示该系统主要由液滴生成及流体驱动装置、PCR扩增芯片及温度控制装置、数字液滴荧光检测装置组成。双路高精度注射泵驱动水相与油相液体经Y型液滴生成装置，产生包裹有单分子级别DNA的液滴；液滴沿Teflon管道连续流过多个恒温加热区，从而实现DNA的扩增；利用470 nm光源激发反应后液滴内的荧光探针，并由CMOS进行信号的捕捉。该系统将全部检测流程集成于一台设备内，由锂电系统为整个系统供能，并设计了相配套的上位机控制及数据分析软件。与传统由多台设备共同组成的dPCR检测系统不同，该系统无需在实验中途进行人工样本转移等操作，只需将待检测样本加入该系统，就可得到样本的定量检测结果。

图2 系统组成示意图

研究团队利用该系统完成了人体血清内HBV病毒的定量检测，对病毒浓度为

103- 105IU/mL的血清样本进行测试，其液滴荧光强度分布与分布频率如图3所示，可以看出，随模板浓度逐渐增高，其阴性液滴占比也逐渐减少。如图4所示，液滴统计结果通过泊松分布校正，可计算出模板中DNA分子的绝对浓度，并与商用定量PCR仪结果进行比较，从图5可以看出，其结果具有很强的线性相关度，经多次重复实验验证，检测结果具有较高的可重复性和定量精度。

图3 (a-c)液滴荧光强度分布及频率分布 (d)液滴荧光图像

图4 样本浓度检测结果

图5 dPCR与qPCR检测结果的比较

综上所述，该系统具有较高的集成度和自动化程度，在便携性和操作难易程度上具有一定的优势，为现场检测奠定了基础。该系统在低水平病原体检测、病毒载荷绝对定量、罕见等位基因检测、拷贝数变异分析等领域具有广泛的应用前景。相关工作以“Fully automatic integrated continuous-flow digital PCR device for absolute DNA quantification”为题发表于《Analytica Chimica Acta》。