透射电镜(TEM)样品制备方法

透射电子显微镜(TEM)是研究材料微观结构的重要工具,其样品制备是关键步骤，本节旨在解读TEM样品的制备方法。

透射电子显微镜(TEM)是研究材料微观结构的重要工具,其样品制备是关键步骤。 以下是TEM样品制备的主要技术：

1.机械研磨和离子溅射：将样品机械研磨成极薄片,再通过离子溅射进一步变薄至电子穿透可见。适用于硬质材料。

2.聚焦离子束(FIB)加工：利用聚焦离子束对样品表面进行精密切割和薄膜制备,制备出厚度均匀的电子透射薄膜。适用于各种材料。

3.超薄切片技术：将样品先用树脂包埋固定,然后用超薄切片机切出厚度仅几十纳米的超薄切片。适用于生物样品和软质材料。

4.电化学抛光技术：利用电化学原理在样品表面进行局部溶蚀,制备出具有特殊形貌的电子透射薄膜。适用于金属和合金材料。

综上所述,不同的TEM样品制备技术适用于不同类型的材料,关键在于根据材料特性选择合适的制备工艺。制备高质量的TEM样品是开展材料微观结构表征的基础。

TEM样品载网

样品载网有不同的形状和材料，最常用和最便宜的是铜网，它们的外径通常为3毫米，并有多种筛孔尺寸可供选择。

载网中间有一个大孔，需要覆盖一层电子透明薄膜。粉末最常用的薄膜是碳膜或孔状碳膜。这些薄膜对电子几乎是透明的，因此只需很少的样品制备工作就能轻松观察粉末样品。虽然这些薄膜可以在实验室制作，但大多数实验室都会购买预制的薄膜以满足自己的特殊要求。

图1 在TEM中用于固定试样的铜网和样品杆

除了保留样品原生状态下的形态和成分这一目标之外，样品制备的主要考虑因素是获得足够薄的切片，以便电子束能够穿过整个样品并从另一侧射出。

树脂聚合物用于支撑样品：比如柔软的生物、聚合物、粘土或微粒，通常在切片前嵌入树脂聚合物中。树脂聚合物必须坚硬，且有一定弹性，可以支撑样品并能从样品块中取出薄片（如70nm厚薄片）。如果样品是冷冻的，则无需在切片前进行树脂包埋。

天然硬质材料也可以通过其他方法制成薄片，例如切割小块，然后将中心区域凹陷、研磨、抛光或用离子束减薄。这样制作出的薄片无需进一步支撑。但这些工艺通常只用于热稳定或无机硬质材料，如金属和陶瓷。

微颗粒可以悬浮在溶剂中，直接放置在支撑膜上。

图2 一个制备不好的试样，只有一小部分透射。热轧镁试样，使用明场 STEM 模式成像。

有机类样品制备方法

有机类和生物类样品在TEM制备中有以下一些特点: 1结构敏感性：有机及生物样品通常较为脆弱,很容易在制样过程中受到损坏。需要特殊的固定、浸渍和脱水方法来保护样品结构。2水含量高：这类样品大多含有大量的水分子,需要经过脱水处理才能制备出真空下稳定的薄膜。3.低衬度：生物大分子如蛋白质、核酸等原子序数低,在电镜下对比度较低,需要使用染色或其他增强手段。4制样困难：由于组织脆弱和含水量高,采用切片等机械手段制备薄膜很容易造成切片变形或断裂。需要更精细的微切方法。5.电子束敏感：这类样品在电子束辐射下很容易发生结构破坏或化学反应,需要控制电子束强度和照射时间。6.取样要求高：需要从复杂的生物样品中精确地切割出感兴趣的区域进行观察,操作难度大。

总之,有机和生物类样品由于其结构脆弱、含水量高等特点,TEM制样需要更加复杂精细的处理方法。样品制备是观察这类样品的关键步骤。

对于生物类样品，有三种主要的样品制备方法可以保存细胞结构并增强衬度。它们是：低温固定法、化学固定法和负染色法。

选择哪种技术处理样品取决于样品的性质、研究的目的以及设备类型。如果需要标记以精确定位蛋白质的样品（免疫标记），或需要切成薄片以观察固有形态的样品，就需要不同的方案。如果只想看到样品的轮廓或表面形状，则需要负染色技术。

无机类样品制备方法

无机类硬质样品在TEM制备中有以下几个主要特点:

1高硬度和脆性:无机材料如金属、陶瓷等通常更硬且更脆。2制样困难:由于硬度高,很难采用切片等机械手段制备出均匀、无损的薄膜样品。需要采用离子轰击、机械研磨等更复杂的制备方法。3电子束辐射敏感:一些无机材料在电子束照射下会发生结构变化或破坏。需要优化电子束强度和样品厚度等参数。4.厚度控制困难:由于硬度高,很难精确控制样品厚度达到TEM观察的最佳范围(通常20-100 nm)。需要多次尝试优化。5.取样难度大:有时需要从块状样品中切割出合适的薄片区域进行观察,这对取样位置的选择提出了很高要求。

总之,无机硬质样品的TEM制备需要更专业的技术和经验,操作过程更加复杂和困难。掌握适合的制备方法是重要的。

粉末

散装易碎材料需要先粉碎成小颗粒或粉末，然后再放到样品载网上，这可以通过使用小的玛瑙杵和研钵来实现，在材料上来回摇动研杵，使其破碎。碾碎成细粉后，粉末颗粒需要分散，然后再滴到载网或支撑膜上。为此，可将粉末加入乙醇等溶剂中，然后在密闭的小瓶/容器中进行短时间（如 30 秒至几分钟）的超声处理。然后用移液管将一滴悬浮材料滴到载网/支撑膜上，颗粒沉降到载网表面，在TEM中观察之前必须让溶剂完全挥发。 大块材料

坚硬的金属样品可以用金刚石锯片切割成薄片。锯片切割时，会沿切割边缘喷洒液体作为润滑剂并减少热量。使用这种锯片将是 TEM 样品制备过程的开始，因为锯片无法切割出足够薄的样品以供观察。它们需要进一步变薄。

图3块状样品TEM制备传统制备流程

1 超声波圆盘切割

使用超声波圆盘切割器从切片样品中切割出一个 3 毫米的圆盘。管状刀片利用振动向下切割样品，如果切割后圆盘没有留在原位，就会从切割管内弹出。然后，圆盘需要通过机械研磨或凹陷来减薄。

安装样品以准备切割圆盘可能需要将切片粘在金属板上。可以使用低温熔点蜡，然后加热去除。将金属底座放在约70摄氏度的热板上，涂上少量蜡，使其熔化。从热板上取下支架，立即将样品放在支架表面融化的蜡上。也可以用磁力将金属底座吸附到超声波圆盘刻刀板上。

将所需区域对准切割工具。在样品上放少量切割介质。将切割工具降至样品表面，用移液管或注射器将粉末润湿，开始切割。

当圆盘完全切过样品切片后，提起切割工具，取下样品板，在热板上再次加热金属板，取出样品。

2 机械抛光和电抛光

有多种抛光方法：机械抛光、超声波抛光、化学抛光和电抛光。

机械抛光也可以通过手工抛光来实现。将样品安装在三脚架抛光机上，抛光机的表面可以在砂粒浸渍的圆盘上做扫动和旋转运动。样品的位置可以通过千分尺螺钉在支架上进行调整。

可以在布盘上装载金刚石膏或其他磨粒。标准的做法是，随着抛光的逐步完善，使用较小等级的磨粒。这样做的目的是使表面光滑如镜，没有划痕。培养良好的抛光技能需要投入大量时间。

电抛光技术只适用于金属样品。它使用一个温度可控的浴槽和一股电流。浴槽充当电解质。它通常是一种浓酸或酸的混合物。阳极和阴极浸入电解液中。阳极（待抛光样品）连接到直流电源的正极，阴极连接到负极。阳极表面的金属被氧化并溶解在电解液中。抛光过程的工作原理是首先去除较高的形貌。

3钉薄Dimpling

对圆盘中心进行减薄称为"钉薄"或"凹陷研磨"。这种技术可以将一些样品减薄到足以观察的程度，但更常用于预减薄到接近电子透明的程度，这样可以大大减少后期离子研磨的时间，并防止减薄不均匀。

块状样品应从两面进行凹凸处理（钉薄轮）。如果样品的相关区域位于一个表面上（例如基底上的薄膜），则应只从"背面 "进行点凹加工。在开始点凹之前，先测量样品的初始厚度，以确定何时点凹足够深。

使用磨料粉来减薄样品圆片。随着薄化的进行,应使用粒度越来越小的磨料。当下一个更小粒度的磨料去除的厚度约为当前磨料粒度的3倍时,效果最佳。最后一步可用于制造无划痕的镜面。

理想情况下，成品圆盘的边缘厚度应为300 μm，中心厚度应小于10 μm。单面凹痕的边缘厚度应为150 μm。

需要经常停止研磨过程，并使用刻度盘上的微米刻度检查凹痕的深度。通常情况下，如果中心位置破了，那么样品将失去作用，需要重新开始制程。

4 离子束减薄

离子束减薄用于轻柔地去除试样上的材料，而不会造成损坏。这一过程通常被称为精密离子抛光。一束离子（通常为氩离子）射向试样圆盘的中心。离子束以浅角度（通常约 5°）射向试样。如果试样已通过凹陷研磨预先变薄，则离子抛光会进一步使试样变薄，直至形成穿孔。如果试样没有经过凹陷研磨，则仍可使用 PIP 研磨试样的整个厚度，但在某些情况下，这需要的时间太长，因此并不可行。因此，用于离子抛光的试样厚度通常小于100微米。

5 聚焦离子束（FIB ）铣削

聚焦离子束（FIB）可用于通过非机械方法制备用于 TEM 的薄样品。一些样品可以用FIB相对快速地切割，不到一个小时就可以制备好。

需要使用FIB技术的材料包括：1.需要薄横截面进行观察，但因硬度太高而无法使用超薄切片技术刀的硬样品。2.需要精确定位（至 20 纳米）制备样品的样品。3.会被机械切割、研磨或抛光损坏的材料。 FIB制备TEM样品是一种高效而精准的方法,具有以下优势：

1.精细取样能力：FIB可以精确地从复杂的样品表面切割出极小区域(通常几十微米大小)进行观察,取样精度高。

2.无需复杂制备：相比传统的超薄切片法,FIB直接从原始样品表面"切出"薄膜,免去复杂的树脂包埋、超薄切片等步骤。

3.制样时间短：整个FIB制样过程可以在即使分钟到几个小时内完成（取决于样品）,大大缩短了样品制备周期。

4.适用于多种样品：FIB可以用于金属、陶瓷、半导体、生物等各种硬质无机样品的制备。

5.原位观察能力：FIB制样可以直接在SEM内部完成,实现了原位观察。

6.灵活性高：FIB制样过程可以根据需求进行实时调控和优化。

总之,FIB制备TEM样品是一种高效、精准的方法,是材料分析中不可或缺的重要手段。

制样产生的假象

在TEM样品中经常发现假象。这可能是最初选择样品时出现的问题，也可能是在制备过程中产生的。TEM的成像目的是观察一个没有假象的样品，所以能够识别假象并确定其原因是非常重要的。 假象可能来自几个来源。例如，在离子研磨/细化过程中，氩离子可能被注入到样品中，这可能导致非晶化和相变。这是由于使用过高的加速电压导致高能离子损坏样品造成的。此外，化学制备程序也可能会在样品上留下污染物。不良的机械抛光会产生不均匀的表面和划痕，留下残留物或在样品中引入位错。如果样品超声处理时间过长或选择了错误的溶剂，即使是样品载网上的颗粒制备也会产生假象。当使用低温技术时，样品必须能够在不损害结构的情况下耐受低温。

对于生物样品，固定会引入假象。由于采集样品和固定之间间隔时间过长，可能会导致样品降解。如果固定溶液与样品条件不匹配，就会发生渗透损伤。固定步骤之间的不良清洗会导致沉淀样品中出现“胡椒状pepper”。

冷冻固定也有与样品厚度和太慢的冷却速度相关的假象。脱水和树脂渗透会导致假象。脱水过快会导致收缩假象。树脂渗透和聚合不良会导致样品中出现孔洞。

材料的超薄切片引入了另一组可能的假象:撕裂、挤压或划痕。

此外，样品染色会导致表面沉淀。在柠檬酸铅染色过程中，即使对样品呼吸过重，也会导致碳酸铅沉淀。设备(镊子)和工作台不清洁会导致油和污染物停留在样品表面。 最后，在TEM样品观察中，如果电子束或等离子体过快地聚集到样品上，也会损坏样品或载网上的薄膜，这个问题非常重要。具体表现有以下几个方面:

1样品表面损坏：电子束的高能量聚焦会导致样品表面产生局部过热和熔融。这种效应会严重破坏样品的结构和形貌,有时甚至会导致样品完全蒸发。对于一些敏感的有机样品或生物样品来说,这种损伤会尤其严重。

2载网薄膜破坏：如果等离子体在清洗的时候过于集中,也会损坏载网上的超薄碳膜或其他薄膜。薄膜破裂或穿孔会导致样品丢失,或者观察区域受到严重干扰。

3.成分变化：高能量照射还可能引起样品的化学组成变化,如氧化还原反应等。

这种成分变化会导致样品的物理化学特性发生改变,影响观察结果的准确性。

4.分辨率降低：局部过热损坏会造成样品表面形貌的粗糙化,降低了TEM观察的分辨率。

为了避免这些问题,在TEM样品观察时需要合理调整电子束或等离子体的照射参数,如电压、电流密度、照射时间等,尽量减少样品受损。同时还可以采用低温、低剂量等特殊技术手段来保护样品。只有样品结构和成分完整,才能获得可靠的TEM观察结果。