浅谈超分辨光学成像

分辨光学定义及应用

分辨光学成像特指分辨率打破了光学显微镜分辨率极限(200nm)的显微镜，技术原理主要有受激发射损耗显微镜技术和光激活定位显微镜技术。

管中亦可窥豹——受激发射损耗显微镜

传统光学显微镜采用宽场成像的方式，照明光一次照亮整个成像范围，然后用相机对整个成像范围进行曝光成像，一次获得整幅图像。“管中窥豹”型的扫描成像则有所不同，照明光聚焦在样品上，形成一个极小的光点——也就是所谓的“管”，每次只对光点对应的区域进行成像;当我们改变光点的位置，使它依次扫遍整个样品，也就获得了一幅完整的图像。有人要问了，即使采用“管中窥豹”的方式，每次聚焦的光点依然受到衍射极限限制，系统分辨能力比起所谓的宽场成像没有提高，扫描过程又增加了系统的复杂度，不是自找麻烦吗?Stefan W. Hell的回答很简单：只要设法缩小“管中窥豹”的“管”，就能提高系统的分辨能力，实现超分辨。

通常的荧光成像是这样的：荧光分子在吸收了照明光(或者叫激发光)A之后，会在很短的时间持续发出荧光B。扫描成像系统的分辨能力取决于A在样品处的聚焦光点大小。Hell找到了荧光的开关——第三种光C，在C的照射下，荧光分子即使吸收了激发光A，也没法再发出荧光B。Hell让开关C同样打在样品上，形成一个四周亮、中心暗的“面包圈”，“面包圈”中心的暗区域比艾里斑还要小;然后把面包圈套在艾里斑上，就像在“管”的出口又加了一个小孔，使“管”的直径大大减少，也就提高了整台显微镜的分辨能力。

“面包圈”限制了激发光A的有效范围

“我只看到星星”“我看到了银河”——光激活定位显微

荧光分子是荧光样品的最小发光单元，由于衍射极限的限制，在相邻的两个荧光分子同时点亮时，我们只能看到一个光斑，但如果每次只点亮一个分子，就可以通过光斑，计算得到荧光分子的准确位置。

Eric Betzig和William E. Moerner采用的就是这样一种方法，如果说STED技术核心是“擦除”，那么PALM技术的核心就是“定位”：Moerner发现存在光D可以“打开”荧光。通过控制D的照射剂量，保证每次只有少量荧光分子处在打开状态;当荧光分子在开与关之间切换时，整幅图像中的荧光信号就会像银河中的星星一样亮暗闪烁，只要进行足够多次的开关和成像，就可以组合出整个样品的图像。

溶酶体膜在不同显微镜下的成像结果。(左)传统光学显微镜成像;(中)光激活定位显微镜成像;(右)放大的光激活定位显微镜成像。

参考使用产品

美国普林斯顿公司-FERGIE

特点：

· 无像差光学设计,完全没有彗形相差;

· FERGIE特有的光学设计可产生衍射极限图像，适用于从紫外到近红外波长的微光光谱应用;

· 集成TE冷却背照式CCD，制冷低至-55°C，允许长的积分时间来检测微弱的信号;

· 帧转移CCD架构，1kHz的频率捕获光谱速率(合并10行);

· 基于FPGA的内部定时发生器;

· 动力学光谱模式，拥有微秒时间分辨率。

美国普林斯顿公司-IsoPlance

特点：

· 无杂散光设计;

· 出色的成像性能;

· 高光通量;

· 动力学塔轮，支持三个光栅，软件控制自动旋转;

· 高效率光学镀膜，可选的银，金或介电涂层的反射率为98%。

审核编辑 黄宇