一种具有高度异质性、高灵敏度-单分子分辨率传感器的开发利用

用于连续监测生物分子浓度的传感器对于在病人护理、工业流程以及环境安全和可持续性方面开发基于生化的监测和控制策略是必需的。传统的生物传感器具有宏观的感测区域，例如电极或光学探测的表面积，收集的信号源自大量分子集合的相互作用，而无法解析单分子层面的相互作用。近年来，传感器已经被微型化，并且开发出了由微型传感器阵列组成的传感器，其中每个单独的传感器都足够小，能够解析由单分子相互作用引起的转变。本文用于研究由单分子分辨率传感器阵列组成的连续传感器中的功能异质性，通过将传感器暴露于分析物浓度变化（增加和减少）超过长时间跨度（25小时）。 该方法是一种基于数千个生物功能化粒子与生物功能化感测表面相互作用的连续生物传感技术。揭示了异质性是由粒子和表面上亲和力分子数量的随机波动引起的，并且响应特性的逐渐变化与单粒子传感器中分子的逐渐损失有关。结果表明了显著的分子和时间异质性，并提供了如何为单分子分辨率的连续亲和力基础生物分子监测设计、精确和稳定的传感器的思路。

近日，来自荷兰埃因霍温理工大学复杂分子系统研究所（ICMS）W. J. Prins团队，在《Advanced Science》杂志发表了题为“How Highly Heterogeneous Sensors with Single-Molecule Resolution can Result in Robust Continuous Monitoring Over Long Time Spans”的文章。该研究对具有单分子分辨率的生物分子传感器由大量传感器组成，这些传感器测量与单分子结合和解离事件相关的态变化。传统上，为了获得足够的统计数据，会从许多单独的传感器中聚合信号。然而，通过聚合信号，传感器之间的差异会丢失，异质性也无法被研究。在这里，我们研究了长时间跨度内具有单分子分辨率的传感器，这使得可以从独立的传感器中收集足够的统计数据。这允许比较传感器，揭示了它们分子组装中与随机变化相关的基本异质性。该研究是通过粒子运动生物传感进行的，这是一种与数千个粒子动态与感测表面相互作用的传感方法。在25小时内，对分析物浓度的一系列调制中，研究了单个粒子的信号。这些结果提供了对具有单分子分辨率的连续传感器的分子和时间异质性的见解，并解释了如何设计传感器以实现稳健、精确和稳定的生物分子监测。 本文主要关注了如何在基本的单分子层面上研究、理解和利用基于亲和力的传感器的功能特性。将为实现能够长时间跨度内精确和稳定监测生物分子的传感器的工程策略和设计奠定基础，以满足广泛的应用需求。

图1基于亲和力的生物分子结合转化为测量信号的传感过程

传感器分为三类：i) 基于集合的传感器，ii) 具有单分子分辨率的传感器组合，以及 iii) 具有单分子分辨率的单个传感器探测。具有单分子分辨率的转导方法能够区分和计数单个单分子结合和解离事件。剂量-反应关系通常通过聚合单分子数据和许多单独传感器组合信号来建立。组合增加了测量数据的统计量，然而，平均过程会导致关于异质性的信息丢失，例如分子之间的差异、分子相互作用之间的差异以及传感器之间的差异。 作者深入研究了具有单分子分辨率的传感器之间的差异，以研究变异性并理解高度异质性传感器如何能够在长时间跨度内实现稳健的连续监测。BPM被用作模型系统（图1B）。BPM是一种利用生物功能化的微米级粒子作为具有单分子分辨率的传感器的生物传感方法。粒子的运动特性受到粒子和感测表面之间可逆亲和力单分子相互作用的影响。在实验中，粒子通过柔性的双链DNA系绳附着在基质上，将每个微米级粒子限制在传感器表面上的亚微米级区域。使用宽场光学显微镜实时测量每个粒子的运动轨迹。   图2在BPM传感器中探测单个粒子，以获得25小时内的单粒子响应 本研究中使用的实验设置将粒子被固定在流动池内的表面上，该流动池连接到一个定制的流体系统，用于长时间跨度的自动化流体交换。作者使用了一个基于竞争的BPM传感器进行测量，该传感器旨在连续监测小分子（糖苷生物碱）。粒子与分析物类似分子的结合导致粒子的运动自由度减少，即粒子从未结合状态转换为结合状态。粒子的视频图像被实时处理，以定位每个粒子的x和y位置作为时间的函数。然后分析运动轨迹以确定切换事件和粒子的相应时间依赖状态。10个分析物浓度-时间曲线系列在25小时内顺序应用于单个流动池，每个系列由8个不同分析物浓度的流体应用组成。在每次流体应用后跟踪粒子15分钟（图2B）。在高分析物浓度下，活动低，因为粒子主要处于未结合状态，因为抗体被分析物分子占据，很少与感测表面上的分析物类似物结合。黑色曲线显示了粒子集合的平均响应，与溶液中分析物浓度呈负相关，这符合基于竞争的传感器的预期（图2B）。有趣的是，单个粒子的响应（红色）显示出高度的变化：不同的粒子显示出明显不同的行为。这些差异可能由时间和非时间异质性引起。时间异质性与单个粒子在结合和未结合状态之间转换的时间点的随机性有关。三个选定粒子的DRCs，分别为它们的第一个浓度系列（左）和所有十个浓度系列的时间平均（右）。根据粒子集合的平均响应，一些粒子确实显示出S形曲线，但令人惊讶的是，粒子也显示出钟形曲线（图2C）。

图3对具有不同数量的粒子端结合分子（NPSB）和基质端结合分子 一个竞争性的基于粒子的传感器被建模为具有NPSB（粒子端结合分子，PSBs）与溶液中的分析物分子以及感测表面上的NSSB（基质端结合分子，SSBs）相互作用。显示了不同数量的粒子结合分子和恒定数量的基质结合分子（NSSB = 10）的模拟时间轨迹示例（图3B）。突出显示了两个时间依赖的粒子属性：PSBs和SSBs之间形成的键的数量（左y轴，红色曲线）和观察到的粒子状态（右y轴，灰色曲线）。当没有PSB-SSB键时，粒子状态为未结合，当至少有一个PSB-SSB键时，粒子状态为结合。图3C显示了单键时间分数，即在只有一个PSB-SSB键时，粒子在单键状态下花费的平均时间分数。对于少量的粒子端结合分子，随着基质端结合分子数量的增加，单键时间分数增加。然而，对于大量的粒子端结合分子，由于形成了多个键，该分数减少。图3D显示了对剂量-反应关系的影响，粒子切换活动绘制在y轴上。对于少量的结合分子，DRC呈现S形，并且随着结合分子数量的增加，曲线向右移动。

图4利用信号-时间曲线的相位对单粒子响应特性进行分类

不同颜色表示不同的区间，在4A和4B两个面板中均有显示（图4A，4B ）。数据显示不同的相移区间与不同的DRC特征相关，从无响应（暗红色）到S形（橙色）到钟形（绿色）。作者在本研究中，开发的分类方法可以研究粒子如何在长时间跨度内改变它们的DRC特征。结果也显示了粒子在25小时内如何改变它们的DRC特征（图4C，4D）。顶部面板与最初（在t = 0时）在面板A和B的橙色区间内的粒子有关，在所有面板中，红色曲线表示第一个DRC（在0到2.5小时之间测量），蓝色曲线表示最后一个DRC（在22.5到25小时之间测量）。顶部面板的结果表明，最初具有S形DRC的粒子在25小时内保持相同的DRC形状和相同的相位偏移，而信号的幅度随时间减少。底部面板显示，最初具有钟形DRC的粒子将其特征转变为S形DRC（具有较低的相位偏移）。具有钟形DRC的粒子具有大量的结合分子和多价相互作用，因此失去结合分子将增加具有单价键的可能性，因此将DRC向S形特征转移。 在粒子与表面之间的结合主要由单价键主导的区域中进行的测量和模拟可以用来估计传感器中结合分子的损失率。在单价结合区域，粒子具有S形DRCs，观察到的活动速度逐渐以每小时约1.6 ± 0.2%的速率减少（图4C）。 文章链接：https://doi.org/10.1002/advs.202412181       审核编辑 黄宇