活体成像新未来：NIR-II多焦点结构照明显微技术

图1：本文基于Feng et al., 2022, NIR-II Multifocal Structured Illumination Microscopy

光学显微镜是人类研究各种生物学问题不可或缺的强大手段。然而，生物组织的复杂组成和异质性带来了严峻的挑战——光线在传播过程中会被生物质散射，严重影响最终获得的空间分辨率和穿透深度。

传统荧光成像技术一般基于可见光(VIS:400–700 nm)和近红外一区(NIR-I:700–1000 nm)这两个窗口。近年来，受益于波长更长的光子在生物组织内传播时散射率更低、近红外二区(NIR-II:1000 1700nm)自体荧光背景更弱等优点，基于NIR-II的荧光成像技术引起了科研人员的广泛兴趣。

在NIR-II区，科研人员可以获得更深的生物组织穿深和更低的背景噪音;另一方面，基于InGaAs传感器的高效短波红外(SWIR)相机的不断进步也极大地促进了NIR-II成像技术的广泛应用。

受NIR-II成像优点的启发，科研人员又开发了几类在NIR-Ⅱ区域发射的荧光探针以及技术，推动了NIR-II成像技术的进步。

创新方案

在这份工作中，科研及研发人员通过将多焦点结构照明显微技术(MSIM)集成到NIR-II荧光显微技术中，首次实现了NIR-II MSIM。该系统在高散射介质2.5mm深度处的空间分辨率达到近1.49μm。

多焦点照明模式是通过聚焦一束相位调制的高斯光束生成的，其波前由加载有计算机生成全息图(CGH)的相位空间光调制器(SLM)整形。系统整体结构示意图请见图2。

图2：NIR-II MSIM系统及原理示意图(a)NIR-II MSIM示意图。BE：扩束器;HWP：半波片;PBS：偏振光分离器;M1-2：反射镜;RL1–4：中继透镜;RM：矩形遮罩;DM：分色镜;OBJ，物镜;MS：移动台;LPF，长通滤波器，TL，管透镜。插图显示CGH 在SLM平面上的轮廓(左)和在OBJ焦平面的模拟多焦图案(右)。(b)NIR-II染料的吸收和光致发光产生的发射。(c)12×12多焦照明模式实验结果。上边界和右边界对应于沿两个正交方向的最大强度投影(MIP)方向。这里，面板(a)和(c)中的ξ和η对应目标焦平面上的笛卡尔坐标。(d)单个NIR-II染料颗粒的NIR-II WF图像(上部插图)和NIR-II MSIM图像(下部插图)的归一化横截面轮廓(点)和高斯拟合(线)。

通过用波长为850nm的激光激发明亮的NIR-II荧光团，该系统可以在0–2.5mm的成像深度范围内以增强的空间分辨率和对比度完成图像重建。见图3以及图4。

图3：NIR-II MSIM系统增强分辨率示意图。(a)、(b)分别为分散的NIR-II染料的NIR-II WF图像和NIR-Ⅱ MSIM图像。下图为图中方框部分的放大结果。(c)沿(a)和(b)下图中所示彩色虚线的归一化强度示意图。(d)两个插图的径向平均强度分布，为(a)、(b)上图二维傅里叶变换的结果。

图4：不同光谱窗口的NIR-II MSIM成像。图像分别为通过截止波长为(a)1000nm的滤光片;(b)1300nm的滤光片的结果。(c) –(e)(a)和(b)中所示虚线的归一化强度分布。

在更长的发射波长下获得的结果也显示出优越的性能。

该工作证明了NIR-II MSIM是一种强大的生物成像观测方法，可以提供深度穿透能力以及增强的空间分辨率和对比度。在未来，将会有更多应用于活体成像领域和跨学科研究的机会。

TPI 产品

图5：本工作中所用到的特励达普林斯顿仪器产品 NIRvana-HS

本工作中的科研与研发人员在采集信号时使用了来自特励达普林斯顿仪器的NIRvana-HS近红外相机。该相机基于InGaAs芯片开发，采用全金属密封的真空腔、先进的深度制冷技术和强大的噪声抑制算法，确保科研人员获得出色的数据。NIRvana-HS为NIRvana家族中帧速最高的产品。如果您的实验需要高帧速红外相机，NIRvana-HS将是您的不二之选。

审核编辑 黄宇