基于微流控组装的探针锁定系统实现无标记miRNA检测

微小RNA（miRNA）是一种约有19至24个核苷酸的非编码RNA，具有高度保守性、时序性和组织特异性。miRNA广泛存在于各种真核细胞中，作为基因表达的重要内源性调控因子，与某些疾病的发生发展密切相关。有研究表明，乳腺癌、肺癌、前列腺癌等癌症的共同特征是miRNA的异常表达。近年来的研究发现，miRNA可以作为一种非侵入性的血液、尿液、唾液分析的生物标志物，在疾病早期筛查与诊断等领域中具有较大应用潜力。

然而，由于miRNA序列较短，而且各种miRNA之间相似度非常高，这些特点对检测方法的适用性和特异性提出了要求。再加上检测过程中复杂样品的蛋白质和脂质的干扰，使得miRNA的检测并不容易。现有的检测方法通常需要复杂的程序来分离、提取和富集miRNA，常常依赖于昂贵的设备和训练有素的操作人员。这些要求限制了现有方法在资源有限的环境下对复杂生物样本的分析应用。因此，开发一种操作便捷、成本低廉且可灵敏检测复杂样本中的miRNA的方法，有助于降低miRNA检测实验对于环境、人员等的高要求，拓展miRNA检测的实验场所。

近日，首都师范大学张璐团队基于微流控可控组装技术，设计制备出了一种探针锁定-解锁可转换系统并将其应用于无标记miRNA检测中，实现了miRNA的低成本、高灵敏度检测。该论文以“Label-free microRNA detection using a locked-to-unlocked transforming system assembled by microfluidics”为题，发表在Lab on a chip期刊上。

具体而言，研究人员利用微流控技术高效合成了探针锁定-解锁可转换系统，该系统的核心成员是DNA序列（G4m）与链霉亲和素磁珠（MBs）的复合物，简称为MBs-G4m。G4m的序列包含miRNA识别序列和富含鸟嘌呤的富G序列。G4m的两端修饰了生物素，MBs的表面修饰了链霉亲和素，使用微流控技术将两者通入微通道内进行可控结合。

经过参数优化，研究人员得到了G4m两端均修饰在同一MBs表面上的复合物，即MBs-G4m。该复合物中的G4m两端被固定，G4m中的富G序列无法自由折叠，使得体系处于探针锁定系统。当该体系遇到目标miRNA时，MBs-G4m复合物中的miRNA识别序列会捕获目标miRNA，形成DNA/RNA双链。

此时溶液中的双特异性核酸酶发挥作用，将DNA/RNA双链中的DNA（miRNA识别序列）降解，目标miRNA会被释放回溶液中进行下一次循环。降解之后，MBs-G4m复合物进入解锁状态，G4m的一端被释放，富G序列可以自由折叠，从而完成了由锁定到解锁的转换。

在解锁状态下，研究人员通过磁分离技术将MBs-G4m复合物从复杂样本中分离出来。解锁态复合物中的富G序列可以与血红素组装形成G-四链体/血红素DNA酶。利用该DNA酶催化底物显色的能力，将目标miRNA的数量信息转换成易于测定的吸光度信息，从而实现了血清等复杂样本中miRNA的定量检测（图1）。

图1 （a）探针锁定-解锁可转换系统检测miRNA原理图；（b）检测miRNA的颜色变化图

综上所述，研究人员利用微流控技术高效合成了探针锁定-解锁可转换系统，只需2分钟就可以制备出足够的MBs-G4m复合物用于miRNA检测实验。该复合物拥有良好的磁响应性和miRNA报告能力，可以通过磁分离减少复杂基质中干扰组分对miRNA检测的影响，实现复杂生物样本中miRNA的准确、简便的定量分析。这种基于微流控技术快速合成探针的新检测体系为在复杂基质中灵敏且方便的检测miRNA提供了一种新的思路。

审核编辑：刘清