开发一种具有梯度设计的微流控系统

抗生素耐药性（Antibiotic resistance，AR）危机在全球范围内日益严重。抗生素耐药性的增加很大程度上是由于在人类医学、兽医学以及畜牧业中对抗生素的过度使用而导致的。抗生素耐药性由多种因素引起，包括过度使用抗生素、缺乏可确定抗生素敏感性的快速实验室测试，以及使用无效或效果较差的抗生素等。因此，推进抗生素敏感性快速测试技术的开发和使用，以识别和表征耐药细菌，从而有针对性地给药是对抗抗生素耐药性的关键。

据麦姆斯咨询报道，近日，美国康奈尔大学（Cornell University）研究人员开发了一种具有梯度设计的微流控系统，可产生与当前国家和国际标准相当的2倍连续稀释的抗生素。研究人员的整合设计，通过最少的处理步骤，将抗生素敏感性测试时间从16~20小时缩短至4~5 小时。研究人员的可行性测试结果与商用抗生素敏感性测试（AST）结果一致，从尿路感染（UTI）的犬类中分离的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的一致性显示为91.75%，并且可在没有预先分离或浓缩的情况下使用。该微流控平台为抗生素敏感性测试提供了一种高效、适应性强的诊断工具。

系统说明

用于抗生素敏感性测试的梯度微流控系统结合了基于纳升级微腔室的抗生素敏感性测试的方法与梯形浓度梯度发生器（LCGG）装置。这种组合为快速实现抗生素敏感性测试提供了标准化和可调控的抗生素浓度分布。该平台由与传统载玻片结合的图案化聚二甲基硅氧烷（PDMS）层组成，可使每个装置测试一种抗生素/细菌组合。每个装置提供10种2倍稀释浓度，并在每种浓度的“一式三份”微腔室中进行测试，其中包括阳性生长对照（无抗生素）微腔室。微腔室从梯形浓度梯度发生器的主要通道中分支出来，用作生物反应器，在抗生素中培养细菌。

图1：梯度微流控系统设计及工作原理

装置的设计和仿真

该装置的一个关键工程挑战是匹配稀释剂（纯培养基）与进入的抗生素的流速，并在每个环路处产生2倍稀释。在没有任何控制功能的情况下，稀释剂将仅能到达环路的一半，因为阻力最小的路径是附近的出口，流体可以从此处流出系统。研究人员通过增加侧通道上的液压阻力来解决这个问题，从而驱动稀释剂到达所有环路。在研究人员设计的梯度结构中，所需浓度分布的阻力近似值可通过电路逻辑模型来计算。

研究人员使用计算流体动力学（CFD）仿真来确定收缩的液压阻力作为其长度的函数（图2b~2d）。计算流体动力学模拟结果表明， 40 μm x 655 μm（宽度x长度）的缩窄具有与混合器相同的液压阻力（图2d）。

图2：计算流体动力学模拟和压力节点网络

操作原理

梯度微流控系统的操作遵循研究人员之前制定的方案。研究人员使用标准化阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤来制备所有溶液， 添加2%v/v PrestoBlue（细胞活力检测试剂）作为细胞代谢指标。该平台的加载包括以下三个步骤：（1）使用注射器将细菌悬浮液加载到装置中；（2）使用注射泵将培养基中的抗生素溶液和清洁培养基通过两个不同的端口加载到装置中，以在主通道网络中产生浓度分布。这一步骤冲走了主通道中的细菌，但留下了那些在终端微室中的细菌。抗生素根据特定的药物加载时间扩散到微腔室中；（3）系统加载生物级矿物油以隔离微腔室。一旦微腔室被密封，芯片上的水浴池就装满了水，然后该装置在37 °C下培养 4~5小时。

在细菌加载、抗生素加载和微腔室密封这三个步骤中，只有步骤2的加载时间随所测试的抗生素的不同而变化。表征抗生素加载到微腔室和产生的浓度分布是最重要的，以确定该系统的操作程序。

图3：梯度浓度的表征

对临床分离株进行抗生素敏感性测试

研究人员用来自犬尿路感染样本中的细菌分离物检测梯度微流控系统在确定最低抑菌浓度（MIC）时的性能特征，这些样本被提交给康奈尔动物健康诊断中心（AHDC）进行抗生素敏感性测试（图4a）。研究人员重点研究了2007~2017年间在该设施培养的犬尿路感染中最常见的四种传染性微生物：大肠杆菌（EC）、奇异变形杆菌（PRM）、粪肠球菌（EF）和假中间葡萄球菌（SP）。研究人员总共检测了30株细菌分离株。这四种细菌占所有病例的66.7%。

图4：梯度微流控系统对临床兽医样本中细菌分离物抗生素敏感性测试效果

综上所述，研究人员设计、优化并使用了一种进行抗生素敏感性测试的梯度微流控系统；包含标准化、易理解的测试参数；然后测试从培养皿分离出的细菌或直接从尿液样品分离的细菌。该系统利用阶梯状网络生成连续2倍稀释的浓度，遵循当前的标准化方法和规定，并且可调节以适应大量临床相关的抗生素和抗生素组合。当使用单一抗生素测试时，包括细菌加载、抗生素加载和油加载在内的总制备时间，最快可达10分钟，而抗生素组合测试也不超过15分钟。该梯度微控控系统的一个重点考虑因素是在微尺度和小空间内对抗生素进行2倍连续稀释。该梯度微流控系统是迄今为止第一个使用电路逻辑在微流控中产生梯度浓度的系统。

医疗设备想要通过审批，需要与如敏化兽医尿路感染台（SVU）等金标准设备达成95%以上的一致性，因此，尽管梯度微流控芯片很有前景，但仍缺乏可接受性。未来，梯度微流控系统应采用自动上料、样品处理、实时图像分析等技术，以提高过程的准确性。此外，还应进行进一步的临床研究，以扩大抗生素敏感性测试平台的使用范围，直接从含有更多相关细菌/抗生素的样本中提取并进行测试，同时检查尿路感染以外的其它疾病模型，以探索该梯度微流控系统在临床诊断中的其它用途。

审核编辑：刘清