一种基于微流体条码标记的空间多组学测序(DBiT-seq)技术

北京时间2020年11月14日，新格元创始人耶鲁大学樊荣教授团队一项新的空间高分辨率多组学研究成果在国际顶级期刊《cell》上发表，文中描述了一种基于微流体条码标记的空间多组学测序(DBiT-seq)技术，该技术基于组织切片的空间结构，将多组学技术与高分辨率的空间信息相结合，可以达到10μm高精度水平，为空间高分辨率组学技术带来了颠覆性的革命！

No.1

主要内容

空间转录组技术在一定程度上提供了基因表达空间异质性信息，但如何在大组织区域内进行高分辨率、多组学、无偏差的生物信息分析仍然是一个科学难题。耶鲁大学樊荣教授团队提出了一种全新的空间高分辨率多组学研究方法——基于微流体条码标记的空间多组学测序(DBiT-seq)。利用DBiT-seq技术，本文分析了小鼠胚胎中早期器官发育的主要组织类型，并展示了小鼠胚胎发育中全转录组和22个蛋白质的空间高分辨率共作图。基因表达和蛋白积累数据进一步确定了胚胎前脑发育和微血管网络的差异调控模式。文章还以10μm像素的高分辨率检测到了排列在视囊泡周围的单层黑色素细胞。

No.2

DBiT-seq技术原理

DBiT-seq工作流程如图所示，将含有平行微通道(宽度为10μm、25μm或50μm)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片置于组织载玻片上，微流控通道用于将分子条形码以空间受限的方式传递到甲醛固定的组织玻片表面。第一种微流控芯片通道在组织切片表面引入带有oligo-dT的DNA条形码A1-A50，可结合组织mRNA并启动原位逆转录形成cDNAs。随后垂直放入第二种微流控芯片通道，引入第二组标记蛋白的DNA条形码B1-B50。A1-A50和B1-B50交叉原位连接，产生组织像素的二维拼接，每一个拼接点都包含完整条形码AiBj的唯一组合(i=1-50, j=1-50)。通过这种巧妙的方法，可以在同一固定的组织切片上同时完成对mRNA、蛋白质，甚至其他多组学物质的条形码标记，后续通过NGS测序结果分析，得以构建一个高分辨率多组学空间图谱，使用过后的组织切片还可以进行成像记录。

另外，DBiT-seq技术不仅可用于新鲜组织切片，还可用于已经固定的标准组织玻片，甚至冰冻的组织切片也可以通过转移到聚赖氨酸包被的载玻片上，使用甲醛固定，在-80℃保存备用。

DBiT-seq的工作流程示意图

No.3

研究结论

1、小鼠胚胎空间多组学图谱

胚胎发育的动态变化，特别是早期不同器官的发生形成，受到时间和空间因素的精确调控，因此本文选择了发育中的小鼠胚胎进行研究，验证这项全新的技术。

研究将DBiT-seq技术应用于50μm像素大小的E.10完整小鼠胚胎组织切片，通过计算获得了mRNA在每个像素中reads数绘制的空间热图(图A中)，以及22个蛋白在每个像素中积累数绘制的空间热图（图A右），并对相邻组织切片进行H&E染色（图A左）。

根据mRNA转录组数据结果，基于无监督聚类将小鼠胚胎细胞分为11个主要集群(图C)，将这些细胞集群映射回空间图谱，发现这些细胞集群与小鼠胚胎发育的主要组织类型密切相关，包括前脑、中脑、后脑、鳃弓、脊髓神经管、心、四肢芽以及主体腹侧和背侧内脏。研究还对13种主要组织类型进行了解剖学注释，并根据mRNA和蛋白的平均积累量生成了组织区域特异性综合图表(图E/F)，进一步发现Notch1蛋白在整个小鼠胚胎中均高表达，暗示了Notch信号在调节小鼠胚胎发育过程中起着至关重要的作用。

小鼠全胚胎空间多组学图谱

2、胚胎大脑的高分辨率图谱

接下来采用更高分辨率(像素大小=25μm)的DBiT-seq技术分析E.10小鼠胚胎组织样本的脑区。Pan-mRNA map图清晰地分辨出更多的脑部精细结构，Pan-protein map图也开始显示出可分辨的精细结构，且两者都与H&E组织图像相关(图A、B、C)。

研究的22种蛋白中，有一半以上在小鼠胚胎脑部区域显示出独特的积累特征（图D）。例如，EpCAM信号在极局部的高度界定区域，具有超高的信噪比。PECA作为一种泛内皮标记物精确地描绘出了小鼠胚胎脑微血管网络，甚至呈现了组织学上难以区分的微血管位置。为了验证这一结果，研究者使用免疫荧光成像技术在邻近的组织切片上检测EpCAM和PECA，结果显示DBiT-seq获得的空间图与免疫荧光染色图像及H&E染色图像能够很好的重叠在一起，在近单像素水平上显示出惊人的完美相关性，为DBiT-seq技术的精确性提供了强有力的证明（图E）。

小鼠胚胎大脑的高分辨率图谱

3、胚胎早期眼睛的空间图谱

在小鼠胚胎发育的E.10时期，眼睛的发育已达到了视囊泡晚期。利用更高分辨率的10μm微流控通道对E.10小鼠胚胎脑区进行了DBiT-seq检测，将得到的空间图谱与相邻组织切片H&E染色图谱进行比较，并对其中四个高表达的基因进行可视化分析。其中，Pax6（广泛参与胚胎器官和组织发育）被发现在小鼠胚胎视囊泡中高度富集。另一个基因Trpm1在视泡周围形成完美的线条。Six6是一种在脊椎动物胚胎中导致视野分化和增殖的基因，显示在视囊泡及周边区域表达。Pmel是色素细胞特异性基因，参与纤丝片的发育，图像显示这个基因围绕着视囊泡表达。这些精美的图像证明了DBiT-seq技术能够高精度地解析组织中的单细胞层结构。

早期眼睛发育的空间多组学图谱

4、空间差异基因表达分析

研究者还对小鼠胚胎E.10、E.11、E.12时期的组织样本进行了全局聚类分析，为了更加精确地注释组织区域，将低分辨率空间转录组的空间差异表达(spatialDE)分析应用于DBiT-seq的数据上。

在E.10小鼠胚胎中，许多内部器官还没有开始发育，但基于DBiT-seq检测已经可以确定20项组织特征，包括眼睛、耳朵、肌肉、前脑和上皮细胞等。随着胚胎的发育，在E.12小鼠胚胎中，甚至能够识别出40个明显的组织特征，包括一些内部器官，如心脏、肺、泌尿生殖系统、消化系统和睾丸等。这些结果表明，DBiT-seq空间高分辨率的多组学数据结合spatialDE自动特征识别分析，可大幅提高组织分辨的精确度，有助于病理样本检测的准确性。

空间差异基因表达特征自动识别

No.2

研究结论

樊荣教授实验室开发了一种全新的高分辨率(~10μm)空间多组学测序技术DBiT-seq，可同时对转录组、蛋白质或其他组学进行研究，利用这项技术对整个小鼠胚胎进行了空间多组学图谱(蛋白质和mRNA)绘制，并获得了许多新的知识。通过DBiT-seq技术检测的转录组信息，可以在小鼠胚胎早期器官发生阶段确定主要的组织类型，重建的空间蛋白表达谱能够很好地解析小鼠胚胎脑组织病理图像中难以分辨的微血管网络，清晰地显示视囊泡周围的黑色素细胞单层。

DBiT-seq是一种全新的空间高分辨率多组学研究技术，由于这项技术不受组织新鲜度的限制，有潜力成为绘制一系列分子信息(蛋白质、转录组和表观基因组)的通用方法。其潜在影响将是广泛和深远的，有望应用于许多不同领域的基础和转化研究，包括胚胎学，神经科学，癌症和临床病理学等。

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