一种基于微液滴-表面增强拉曼光谱的单细胞检测平台开发

乳腺癌（BC）是女性最常见的恶性肿瘤。在BC的四种亚型中，三阴性乳腺癌（TNBC）因其侵袭性强、易转移、预后差、易复发、易耐药等特点，生存率明显低于非转移性亚型。同时，TNBC缺乏广谱的标记受体。因此，寻找合适的生物标志物进行早期诊断和不同亚型的检测对癌症治疗至关重要。

近期，吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室徐抒平课题组报道了机器学习辅助表面增强拉曼光谱学（SERS）用于基于微液滴的单细胞分析检测，相关成果以“Single-Cell Analysis and Classification according to Multiplexed Proteins via Microdroplet-Based Self-Driven Magnetic Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Platforms Assisted with Machine Learning Algorithms”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上。

该研究构建了一种基于微液滴-表面增强拉曼光谱（microdroplet-SERS）的单细胞检测平台，并开发了单细胞异质性分析和不同BC亚型分类的工作流程。单细胞与捕获探针（免疫磁珠，iMBs）和报告探针（immuno-SERS标签，iSERS tags）一起被包裹在微液滴中。在微液滴中，观察到iMBs的一种独特的界面定向聚集（IOA）效应，即带负电荷的细胞膜倾向于吸引电中性捕获探针（iMBs）自发地向细胞膜表面聚集。进而外泌体蛋白和iSERS tags会被生物偶联在iMBs上，形成三明治夹心结构，通过对iSERS标签的SERS信号采集实现对外泌体蛋白的分析。实验中分析了3种外泌蛋白（FAK、CD9、CD63），因而制备了3种报告分子标记的iSERS tags。iSERS tags在iMBs上的富集产生的热点效应对SERS信号的放大极为有利。

图1 基于微滴的自驱动磁SERS平台辅助机器学习算法工具的基于多重外泌体蛋白的单细胞分析和分类的原理图

实验中对iMBs聚集到细胞膜表面的动态过程进行监控。可观察到5分钟之内iMBs可以聚集在细胞膜表面。对25个液滴内的细胞表面的iMBs数量统计显示出较好的一致性。进一步地，液滴内的细胞在裂解液的作用下释放游离的外泌体蛋白并被iMBs捕获，并与iSERS tags形成免疫三明治结构，进而进行SERS检测。图2C为三次实验的细胞外泌体蛋白的检测结果。

图2 （A）动态监控磁珠聚集过程；（B）不同单细胞表面磁珠的数量；（C）三次平行实验的结果

对获取到的两种细胞系的光谱数据进行降维和聚类处理，分组聚类热图和降维算法可以很好的区分两种细胞系。聚类分析显示出4种亚群，这与蛋白的表达特征有关。

图3 （A）两种细胞系三种蛋白水平的分组聚类热图；（B）聚类分析；（C）t-分布随机邻域嵌入（t-SNE）降维散点图；（D-F）三种蛋白的水平分布

利用随机森林分类模型可区分两种BC细胞系，其中训练集和测试集都显示了良好的准确率。采用受试者工作特征曲线（ROC）评价分类器的准确率，曲线下面积（AUC）值为0.938，接近于1，表明该分类器性能良好。

图4 随机森林分类模型以及对模型的评估：（A）随机森林错误率矩阵；（B）用训练集测试分类器；（C）分类器用测试集进行测试，单位为%；（D）分类器的二分类ROC曲线；（E）利用MDA和MDG指数对三个变量的重要性排序

综上所述，该研究建立了一种基于微液滴的表面增强拉曼光谱方法，用于单细胞水平分析外泌体蛋白。该方法的关键是界面定向聚集效应，可以通过聚集被探测细胞膜表面的捕获探针来收集目标蛋白和报告探针，使分散的蛋白富集到检测点，同时通过形成热点来放大信号，以提高液滴内检测灵敏度。基于该平台的检测灵敏度可以达到单个细胞的外泌体蛋白检测的要求。此外，该研究引入了机器学习算法，用于发现单细胞数据集中不同亚群的存在，并分析不同蛋白质之间的关联。基于单细胞数据集，该研究发现了不同亚群的不同性能特征，证实了单细胞存在明显的异质。





审核编辑：刘清