滨松LCOS-SLM 新型号X15223用于双光子激发显微成像

滨松光子学株式会社的科学家们根据弯曲样品的表面形状，使用滨松LCOS-SLM进行激发光波前调制，从而使双光子激发显微镜(TPM)(物镜为干镜)可以进行高质量的深度观察。当空气和样品之间的折射率界面是垂直于光轴的平面时，通常会发生严重的球差。弯曲的样品表面形状和折射率不匹配会引起包括球差在内的各种像差。因此，所获得的图像的荧光强度和分辨率在样品的一定深度处变得很差。为了解决这个问题，滨松中央研究所及滨松大学的科学家Naoya Matsumoto, Alu Konno, Takashi Inoue 及 Shigetoshi Okazaki等人设计了一种预畸变波前，以通过使用全新的光程差算法来校正由弯曲的样品表面形状引起的像差。在通过折射率不匹配的界面之前，TPM系统中包含的空间光调制器将激发光波前调制为预畸变波前。因此，激发光经过样品后聚焦时就没有像差。由此，通过使用干物镜在清洁的小鼠脑中观察到高达2,000μm的光学深度的血管。

近年来，随着生物技术和医学领域研究的发展，人类社会也一直在推进生物机能和疾病发病机理的研究。但是由于以往的观察手段具有一定的局限性，对未作处理的动物内脏更深部结构的3D观察需求日益增长。

双光子激发显微成像是一种通过用超短脉冲激光激发(照射)荧光物质来观察激发的荧光的技术。 普通的光，通过散射和吸收是无法达到样本深部的，而激发光可以，故激发光是3D观察的有效手段。但是，对于实际生物体来说，因组织本身发生的像差而导致无法观察深处部位。虽然如前面介绍的自适应光学器件可以消除相差，但这与眼底成像不同，因为各种各样的原因不适用显微镜观察，只能在限定的条件下使用。

滨松公司搭建了搭载SLM的双光子激发显微镜，在此基础上研究像差补偿的方法。首先，我们需要知道的是波前畸变(像差)。 由于这样的系统很难应用自适应光学，因此无法使用波前传感器进行测量。另外，与在激光加工中待加工的样品不同，作为在显微成像中待观察的生物活体不仅形状不确定，其内部也有复杂的折射率分布，从而不能计算像差(图1左)。因此，我们假设活体内的折射率是一定的，将复杂的表面作形状近似的简单处理，在相似的条件下，通过较少的参数(平均折射率、形状的相似系数等)设计了全新的像差计算方法。

图1 在显微镜下观察的生物样品(左)和近似模型(右)的波前畸变(像差)

图2显示的是采用我们像差计算方法来观察生物样品的结果。样品是采用市面上销售的液体透明化处理的小鼠大脑(a)。在过去大约10年左右的时间里，透明技术得到了快速的发展。这也是3D观察需求大幅增加的一个重要原因。

图2鼠脑预扫描结果

·(a,b)荧光染料(Dil)染色的鼠脑照片。使用光学清洁介质(SeeDB)增强光学透过率。测量位置靠近(a)中蓝色箭头指示的位置。

·在不同的观察区域时——浅表区域(c)与深层区域(d)——激发光穿过样品表面的面积与样品的尺寸间的关系。黄圈表示激发光穿过的面积，红色虚线框表示预扫描的范围。

·(e)为XY面的图像，深度距离起始测量位置210μm。比例尺单位为200μm.

·(f)为计算所得样品表面形状。

图3中间左列(a)，(b)和(c)是用新的像差校正方法获得的三维成像图片，读取的不同深度的XY轴的成像图像。与右列没有进行像差补偿的(d)，(e)和(f)相比，它的分辨率、信噪比(SNR)要高。通过查看(g)，(h)和(i)中的图形所示的每个图像的轮廓也可以看出进行像差补偿后的效果。如果不进行像差补偿，图像的对比度会随着深度的增加而降低，在最深(1,798 μm)处结构就变得不清楚了。另一方面，如果做了像差补偿的话，即使在深处的结构也可以获得很好的成像。

虽说双光子激发显微镜适用于三维观察，但是如结果所示，因为像差的影响，实际上普通的观察是很难实现对深部成像的。 但是，通过使用我公司开发的SLM进行像差校正，可以观察表面不平整的生物样本的深处。 此外，因为同时照射多个点的高速成像和像差补偿可以同时进行，在实际实验中的高速成效效果是有目共睹的。

图3鼠脑中血管的xy平面图片。

(a,b) 400μm光学深度处使用SLM调制波前的图像和未调制波前的图像。 (c,d) 光学深度1116μm处的图像。(e,f) 光学深度1798μm处的图像。比例尺单位为50μm。虚线框为血管局部放大。通过SLM调制波前，大幅地提高了对比度和分辨率。

各种应用的开发

如此这般，通过采用SLM进行波前控制，通过多点同时照射，实现高速成像，再通过像差补偿得到高品质成像，作为激光加工和成像的例子中已有所说明。多点同时照射也用于对相邻多个点同时照射，以引起相互作用并进行特殊处理，对离开活体的细胞和组织同时进行光刺激。波前控制也为实现各种各样的功能发挥作用，例如提高超出光学系统界限的分辨率(超分辨率)，生成从浅部到深部聚焦的特殊光束(非衍射光束)等。利用基于SLM的波前控制，除了可以轻松实现各种光学功能外，也可以实现动态切换、同时多种功能。利用此特点，除了用于激光加工和成像外，还适用于各种目的和领域的研究，例如光学操纵、量子光学和太赫兹波的产生等等。另外，虽然此次没有介绍，我们也有各种对于超短脉冲光的时间波形控制的研究。

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图4 实验搭建

操纵模拟生物组织内的光传输路径

所用SLM型号：-07无水冷型号

应用内容：生物组织具有各向异性的物理特性，入射到其中的光会发生漫射现象。这也是我们无法看到生物组织内部的主要原因。我们使用空间光调制器对入射光的波前进行整形，有效地补偿了光在生物组织内部传输过程中所发生的波前畸变，从而实现对光传输路径的操控。光经生物组织实现聚焦是光路操纵的一种直观形式，它对于激光扫描成像、激光靶向治疗以及激光显微操纵等应用都具有重要意义。

图5两幅分别为使用滨松空间光调制器调制前后的图。左图为高斯光打到样品上(使用氧化锌模拟生物样品)，激光被样品散射所得到的散斑;右图为经过客户算法调制后的光斑，使用滨松空间光调制器调制，调制后可见一个聚焦很好的点，为算法重构的点。

图5 实验效果

审核编辑黄宇