用于跟踪单个分枝杆菌细胞中药物反应动力学

药物疗效的临床前分析是药物开发的关键。然而，传统的群体细胞分析只能静态评估平均群体行为，对药物逃逸细胞的分辨率较低。而对疗效的不准确评估，往往要么导致高估候选药物的疗效，但无法在临床得到证实，要么则导致有价值的候选药物被拒。延时微流控显微镜是一种高时空分辨率的药物表征方法，但目前还难以大规模应用。

据麦姆斯咨询报道，近期，法国巴黎大学（Université de Paris）的研究人员报道了一种以液压气动机制运行的模块化微流控细胞培养室，其特点是具有特别高的纵横比。通过复制该功能单元，并将其与双入口微流控稀释系统相结合，研究人员得到了一个可以同时设置五种药物浓度条件的微流控平台。

该微流控平台由两个入口和一系列蛇形微通道组成，这些微通道依次通过五个独立的腔室组实现对流入溶液的滴定。最终，通过宽视场倒置显微镜对这些腔室进行时间分辨观测，研究人员能够直接捕捉到单个分枝杆菌细胞在给药前、给药中和给药后的生长情况、死亡率和存活率。

图1 连接到多通道微流控流量控制器（Fluigent）的五条件微流控装置示意图。第一个通道首先连接到三个独立的储液池，随后依次连接到一个由软件控制的双向位置阀，以实现不同浓度条件的切换。

生成不同的梯度模式来模拟药物动力学

如图2a所示，为了在五条件微流控平台中产生浓度梯度，研究人员从进样口注入两种不同的溶液，使之分别流入两个独立的蛇形微通道。随后，后者分叉为外部和内部两个蛇形微通道，其中外部蛇形微通道中的溶液保持原来的浓度，而内部的蛇形微通道充当混合器，使流入的溶液在此混合。

接着，三个蛇形微通道中的每一个都继续分叉，产生两个外部蛇形微通道和两个混合器，之后进一步分叉并产生最后一个包含两个外部蛇形微通道和三个内部混合器的稀释水平。在每个稀释水平下，蛇形微通道内的流量是相同的，而在每个分支的连接部分，流向系统外部的流量更大，流向系统内部的流量更小。

这种网络结构产生的浓度梯度是线性的。从最后一个稀释水平开始，溶液流入五个独立的腔室组（C1-C5），每个腔室组有四个微腔室。最后，每组腔室连接到相同的出样口，以最大限度地提高整个微系统的流动稳定性。

图2 五条件平台的梯度构造表征

此外，为了量化浓度梯度，研究人员将溶入异硫氰酸荧光素（FITC）的7H9培养基溶液注入第一个进样口，并将不含荧光的7H9培养基溶液注入第二个进样口。研究发现，在稳态下，测得的梯度与理论预期相差最小，此时，FITC溶液在C1中未稀释，在C2中稀释到约72%，在C3中稀释到约48%，在C4中稀释到约25%，在C5中不存在。

为了模拟典型的PK曲线，研究人员还生成了脉冲形的FITC梯度，其峰值浓度与静态梯度得到的浓度不同。其中，FITC溶液在峰值浓度时，其在C1中未稀释，在C2中稀释到约82%，在C3中稀释到约54%，在C4中稀释到约21%，在C5中不存在。

通过双向开关阀，在不同时间间隔交替灌注非荧光和荧光溶液，可以产生静态和动态梯度。有趣的是，只有在进样口上游集成了电容时，才能获得模拟PK的脉冲形梯度。总之，通过将稀释树网络与微流控培养室集成，研究人员创建了一个适合在空间和时间上滴定分子的微流控平台。

莫西沙星对耻垢分枝杆菌微菌落的作用具有剂量和时间依赖性

为了测试平台的运行，研究人员研究了不同药物浓度对耻垢分枝杆菌生长速度的影响。其中，研究人员重点研究的莫西沙星是一种靶向II型拓扑异构酶DNA旋转酶的氟喹诺酮类药物，其在抗击多药耐药菌株的抗结核治疗过程中发挥着至关重要的作用。为了监测莫西沙星对靶标的影响，研究人员通过将系统中的mCherry基因与GyrA染色体融合，生成了GyrA的红色荧光报告基因。

研究发现，在不存在莫西沙星的情况下，细菌呈指数级生长，但随着药物浓度的增加，细菌的微菌落大小显著地逐渐减小，在最高浓度时，细菌的生长迅速停止。且与未给药的细胞相比，研究人员观察到最高浓度的莫西沙星显著抑制靶标，而较低浓度的莫西沙星会诱导靶标。

此外，在给药的前6小时，研究人员没有测量到在不存在药物或存在不同浓度药物的情况下微菌落生长速率的显著变化。而在给药的最后6小时，微菌落生长速率开始显著放缓，并在无药物的恢复阶段继续下降。此外，研究人员观察到在相同给药浓度下，克隆微菌落生长速度存在显著异质性。

最后，研究人员检验了体外模拟的PK参数与生长速率是否相关。有趣的是，研究人员发现，当给药浓度高于最小抑制浓度（MIC）时，细菌生长速率与剂量（R² = 89.8%）和时间（R² = 90.8%）之间都存在负相关关系。相比之下，研究人员发现生长速率与曲线下面积（AUC）和MIC的比值之间没有显著相关性。

总之，研究人员利用该微流控平台在高细胞分辨率下分析了PD性质以及PD-PK关系，发现莫西沙星对耻垢分枝杆菌微菌落的作用具有剂量和时间依赖性。

图3 莫西沙星脉冲梯度对耻垢分枝杆菌GyrA-mCherry报告基因的作用

总的来说，这项工作是首个用于生长缓慢的细菌细胞的单细胞剂量-反应试验的概念验证工作，该研究中创建的微流控平台具有良好的在高时空分辨率下研究PK-PD关系的能力。此外，与间接推断药物耐受细胞存在的群体细胞分析方法不同，该微流控平台允许直接检测不同的单细胞在药物作用下随时间的变化，为药物发现提供技术进步。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41598-022-24175-9

审核编辑：刘清