氨基酸低频拉曼光谱发现第二个指纹区域

文摘

Princeton Instruments SCT 320 IsoPlane Schmidt-Czerny-Turner (SCT) 光谱仪是一种新颖的无像散光谱仪设计，与传统的 Czerny-Turner (CT) 光谱仪相比，其拉曼光谱具有更好的分辨率和信噪比。单级 SCT 摄谱仪已与新型低频拉曼光谱模块连接，该模块使用体积相位全息光栅作为瑞利线滤波器。该系统已用于测量几种结晶氨基酸的低频拉曼光谱。L-胱氨酸的光谱显示峰距离瑞利线接近10 cm -1是可测量的。光谱显示出复杂的峰模式，可用于轻松区分不同的酸，从而形成所谓的“第二指纹区域”。虽然这里描述的系统对于低频拉曼工作有用，但对于检查样品的高频模式也很有用。

介绍

车尔尼-特纳 (CT) 光谱仪几十年来一直用于测量样品的拉曼光谱。1,2 CT 摄谱仪设计中固有的光学像差，包括像散、慧差和球面像差。3 当使用镜子将光源聚焦到离轴时，就会出现像散，从而产生扭曲的图像和展宽的光谱峰值，从而降低光谱分辨率。当使用镜子对离轴源进行成像时，会发生慧差，并产生具有彗星状尾巴的图像和具有不对称加宽峰值的光谱。球面像差是由于使用球面镜聚焦图像而引起的，导致图像对称模糊和光谱展宽。这些光学像差是物理定律的结果，并且存在于 CT 光谱仪中，无论其制造商如何。

CT 设计中固有的像散、慧差和球面像差的最终结果是拉曼峰质量较差。如图1所示，用CT光谱仪测量的环己烷802 cm -1拉曼位移峰具有不对称线形，变宽，因此降低了光谱分辨率，并且峰很短，从而降低了信噪比(SNR)。

针对CT 摄谱仪的问题，Princeton Instruments 开发了 Schmidt-Czerny-Turner (SCT) 摄谱仪，或IsoPlane® SCT 320 摄谱仪。与 CT 设计相比，SCT 光谱仪在整个焦平面上的所有波长上都具有零像散，并且彗差和球面像差水平降低。图1显示了用CT和SCT光谱仪测量的环己烷802cm -1拉曼位移峰的比较。SCT 峰具有对称形状，比 CT 峰窄，因此具有更好的光谱分辨率，并且更高，从而产生更好的 SNR。通过减少光学像差，SCT 光谱仪提供的拉曼光谱比 CT 光谱仪具有更好的分辨率和信噪比。

图 1.使用 Czerny-Turner(红色)和 Schmidt-Czerny-Turner(蓝色)IsoPlane 光谱仪测量环己烷的802 cm -1拉曼位移带。这些光谱是在焦平面的中心测量的。(532 nm 激发，玻璃管中的样品，180° 反向散射，背照式 CCD，1200 g/mm 光栅。)

低频 (10–200 cm -1 ) 拉曼谱带提供固体中晶格模式的信息，可用于区分活性药物成分多晶型物，4提供有关无机和有机金属化合物中金属离子的信息，并用于确定碳纳米管的直径来自径向呼吸模式的峰值位置。

传统上，需要三重单色仪来抑制瑞利线，从而允许测量低频拉曼光谱。Ondax 的新型低频拉曼分析系统XLF-CLM 使用体相位全息光栅作为超窄陷波瑞利线滤波器。该系统拒绝足够多的弹性散射光子，从而仅使用单级摄谱仪就可以观察到距离瑞利线近10 cm -1的谱带。这使得低频拉曼系统重量轻、易于使用且价格合理。

该系统的局限性在于它只能在一种激发波长下工作，在本例中为 785 nm。此外，由于使用了体相位全息光栅，该系统无法在紫外线下工作。因此，三重单色仪对于使用多激光激发线、拥有可调谐激光系统或在紫外线下工作的研究人员来说仍然有用。而且，由于三重单色仪包含三个光谱仪，因此它可以比本文描述的系统产生更高分辨率的光谱，而本文描述的系统的分辨率因仅使用一个光谱仪而受到限制。

XLF-CLM 低频拉曼前端已与Schmidt-Czerny-Turner 摄谱仪连接，以产生高质量的低频拉曼光谱。已经用该系统测量了几种氨基酸的低频拉曼光谱。令人惊讶的是，观察到了独特而复杂的峰模式，使这些光谱的 10-200 cm -1区域成为“第二指纹区域”。该波数区域可能对于区分具有相似化学结构的化合物非常有用。

实验

分析的氨基酸为胱氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。氨基酸以结晶固体形式购自 Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)并按原样使用。在所有情况下都对L 异构体 进行了分析。样品装在带有旋盖的玻璃瓶中。小瓶具有可重复但较小的荧光光谱，在数据处理之前从样品光谱中减去该光谱。

Ondax(加利福尼亚州蒙罗维亚)的XLF-CLM 低频拉曼分析系统用于测量低频拉曼光谱。该模块包含样品架、聚焦物镜、785 nm Ondax SureLock™ 激光器、放大自发发射滤光片、中性密度滤光片以及光密度 >8 的 Ondax SureBlock™ 专有固体玻璃体全息光栅。以 180° 反向散射模式收集光。使用~50 mW 的激光功率。来自 Ondax 系统的光通过单芯 25 μm 直径光纤耦合到光谱仪。

使用的摄谱仪是Princeton Instruments (Trenton, NJ) IsoPlane SCT 320 Schmidt-Czerny-Turner 摄谱仪。该光谱仪的焦距为 320 mm，配备 600 槽/mm 光栅，闪耀波长为 500 nm。IntelliCal® 波长校准系统的波长轴。波长校准的精度为0.01 nm。通过获取硫的低频拉曼光谱并将其与文献进行比较来检查校准。8 20 至 220 cm -1之间的 8 个硫峰的测量值和文献峰位置与标准偏差 0.57 cm -1一致。L-胱氨酸光谱中测量的五个峰与文献值4的比较产生0.29cm -1的标准偏差。测量了斯托克斯和反斯托克斯光谱。

使用的相机是带有eXcelon®的 Princeton Instruments PIXIS:400BRX 背照式深度耗尽传感器。CCD 冷却至-70°C。在芯片中心定义了 15 行高的感兴趣区域，并且该区域中的所有行都被垂直分组。发现该区域之外的传感器行包含可以忽略不计的信号计数。使用Princeton Instruments LightField® 软件 v4.5控制设备并收集数据。使用 Thermo Fisher Scientific(马萨诸塞州沃尔瑟姆)的 GRAMS v9.1 软件处理和显示数据。

结果与讨论

拉曼光谱经常以4000 至 200 cm -1的位移进行测量。靠近瑞利线的峰很难看到，因为该峰的尺寸和宽度都很大。三重单色器6可以抑制大多数瑞利散射光子并允许看到低频拉曼位移。然而，这些系统庞大且昂贵。因此，10 至 200 cm -1的拉曼位移不像高频拉曼峰那样被常规测量。

L-胱氨酸的光谱可以很好地测试拉曼系统接近瑞利线的能力，因为它在 5 和 10 cm -1处有已知的峰。4,6图 2 显示了使用Ondax 低频拉曼前端和Princeton Instruments IsoPlane 摄谱仪测量的接近瑞利线的胱氨酸光谱。请注意，在 9.7 cm -1处有斯托克斯峰和反斯托克斯峰，证实该系统可以距离瑞利线近至 10 cm -1 。图 2 显示本系统中的体全息光栅在抑制瑞利线方面表现出色，这意味着现在只需要单级光谱仪即可获得低频拉曼光谱。

图 2. 靠近瑞利线的胱氨酸拉曼光谱。注意 9.7 cm -1处的斯托克斯峰和反斯托克斯峰。

虽然该系统提供低频拉曼光谱，但使用粗光栅和调整中心波长可以同时观察到低频和高频峰，如图3所示，它显示了来自15～800cm -1。

图3.胱氨酸的拉曼光谱，表明本系统可以同时获取低频和高频光谱。

在拉曼位移大于 200 cm -1时采样的振动通常涉及单个官能团或单个分子，这些振动最好表征为内部或分子内模式。低于 200 cm -1 ，可以看到涉及分子群的模式。这些振动常常涉及一个或多个分子的受挫平移或旋转(振动)。这些类型的振动被称为外部或分子间模式8，在固体晶格模式的情况下，振动被称为声子，并且可能涉及晶胞的运动。有机晶体的晶格模式通常低于 130 cm-1。8具有芳香环的分子通常在该区域具有一系列特征，并且通常具有强烈的低频拉曼峰。

图 4. 使用本文所述的低频拉曼散射模块和 Schmidt-Czerny-Turner 摄谱仪测量的结晶氨基酸胱氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的低频拉曼光谱

请注意，图 4 中光谱中最繁忙的区域位于50 至 150 cm -1之间。对于这一观察结果的一种可能的解释是，在该区域中，外部模式和内部模式的能量重叠，导致振动相互作用，例如费米共振，从而在光谱中添加峰值，从而使它们的外观变得复杂。50 cm -1以下的区域并不复杂，因为也许只有晶格模式落在如此低的能量下。150-200 cm -1区域相对安静，可能是因为大多数内部模式都落在这个区域，并且许多氨基酸在如此低的能量下可能不会振动。即将出版的出版物中包含对图 4 中每个光谱及其与已知文献值的比较的详细讨论。

结论

施密特-车尔尼-特纳摄谱仪与低频拉曼散射模块配对，该模块包含激光器、样品架、放大受激发射滤波器和体积相位全息光栅，以滤除瑞利线。该系统用于研究几种结晶氨基酸的低频拉曼散射光谱。L-胱氨酸的光谱在10 cm -1处有一个由该系统观察到的已知峰，这表明它能够看到距离瑞利线接近10 cm -1的峰。10 至 200 cm -1之间的氨基酸光谱显示出每种化合物所特有的复杂的强烈峰模式，这些峰可能来自于晶格模式、低频内部模式及其相互作用。该区域的细节水平足以将其称为“第二指纹区域”。

审核编辑 黄宇