UL-1000超微量可见分光光度计测定RNA质量检测应用方案-电子发烧友网

简介

核糖核酸(缩写为RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤、G鸟嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。

原理细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类，不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA等杂质，最终获得高纯度RNA产物的过程。

仪器及试剂

美析UL-1000超微量可见分光光度计

离心管离心机电泳槽凝胶板

细胞样品
RNA提取试剂盒荧光定量PCR Mix TRIZOL dNTP氯仿逆转录酶MMLV异丙醇Taq酶DEPC水ddH2O TE MgCl2琼脂糖溴化乙锭MOPS甲醛乙酸钠EDTA EB溴酚兰
样品RNA的抽提
1. 取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2. 两相分离每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3. RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000 rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4. RNA清洗移去上清液，每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000 rpm离心5分钟。
5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6. 溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA质量检测
1.紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将紫外分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
（1）浓度测定
A260下读值为1表示40 ug RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260x稀释倍数x 40 ug/ml。具体计算如下：

RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀释至495 ul的TE中，测得A260= 0.21

RNA浓度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml或0.84 ug/ul

取5 ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ul，剩余RNA总量为：

35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

（2）纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2. 变性琼脂糖凝胶电泳测定
（1）制胶
1 g琼脂糖溶于72 ml水中，冷却至60℃，10 ml的10 x MOPS电泳缓冲液和18 ml的37%甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS电泳缓冲液

浓度成分

0.4 M MOPS，pH 7.0

0.1 M 乙酸钠

0.01 M EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1xMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。

（2）准备RNA样品
取3 ugRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10 ug/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。

（3）电泳
上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。5-6 V/cm电压下2 h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3 cm。
（4）紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

结果计算

RNA得率有很强的组织特异性，不同组织RNA的丰度和RNA提取的易难程度共同决定了该种组织的RNA得率。一般来说，可通过分光光度计测定RNA溶液在260nm处的吸光值来计算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、溶液浑浊度、杂质浓度和蛋白等有机物的吸收值。用标准样品测得在波长260nm处，1ug/mlRNA钠吸光度0.025（光程为1cm），即OD260=1时，样品中RNA浓度为40ug/ml。通常分光光度计OD260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的。因此RNA提取结束后，要根据大概产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度计检测。按下面的共识计算总RNA浓度：

总RNA浓度（ug/ml）=OD260×稀释倍数×40ug/ml

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