一种方法实现实际样品中与疾病相关多肽的检测

病原体循环标志物的检测对于疾病的诊断和治疗监控意义重大，但由于免疫复合物导致的屏蔽作用，以及不同病原体蛋白质与抗体间的的交叉反应，传统免疫测定法的灵敏度和特异性较差。通过质谱方法对标志物蛋白中序列特异的多肽检测可以很好的解决上述问题，甚至是对由于微小序列突变蛋白，或者是不同亚型细菌/病毒引发的疾病进行分型。然而，质谱检测需要相对昂贵的设备和熟练的技术人员，因此不利于在传染病经常流行的、但资源有限的发展中地区广泛推广。

为了解决这些问题，来自杜兰大学的胡晔教授课题组致力于寻求使用纳米孔作为质谱的经济替代技术的可能性，并将该技术用于临床样本中多肽生物标志物的精准识别和检测。基于纳米孔的传感器可以在特定的施加电压、pH和盐浓度产生特征离子电流，并且该信号会在特定分子的相互作用产生非常敏感和特异的信号变化，从而形成对应于特定靶标特异的特征谱。这种原理已经在核酸检测和测序中被广泛应用。最近的研究还表明，由肽-纳米孔相互作用产生的特征信号实现多肽标准品的精准鉴定。然而，由于临床样本成分的复杂性，基于纳米孔的多肽传感器在临床实际应用中的可行性仍有待探索。

据麦姆斯咨询报道，为了填补基础研究和临床纳米孔应用之间的这一空白，近期，胡晔团队在Nano Today上发表了文章“Nanopore-based disease diagnosis using pathogen-derived tryptic peptides from serum”，开发了一种方法实现实际样品中与疾病相关多肽的检测。

研究人员首先运用理化性质分析预测出高度抗原性的多肽序列，这种序列的多肽不仅可以和疾病高度相关，还可以与纳米孔相互作用产生特异性的信号。接着，研究人员进一步筛选纯化出对该多肽具有高度亲和力的单克隆抗体。通过对血清样本进行简单的胰蛋白酶消化处理，该抗体便可以通过免疫沉淀的过程在血清样本中高效的富集、纯化和回收靶标多肽。随后，研究人员利用定制的算法对靶标多肽与纳米孔相互作用产生的电信号进行鉴定和统计学分析，并且确定了具有特定的峰值电流和滞留时间的高度独特的特征信号谱，实现了在宽的线性范围内对靶标多肽的检测。

多肽分析结合免疫纯化技术实现纳米孔在临床疾病诊断中的应用

此外，研究人员还进一步研究了几种可能影响纳米孔传感器开发的主要临床干扰物，并优化了样品制备步骤以去这些干扰物对于测量的影响。以结核病为例，研究人员证明该方法可以将来自肺结核病人的血清，与来自非疾病对照的血清，以及在长时间抗结核治疗后的病例区分开来。

该方法仅需要膜片钳记录装置（用于纳米孔的设备），以及用于血液样本采集和临床分离的常规临床实验室设备。然而，该方法的样品前处理仍然需要一些人工操作，从而离实现高通量还有一定距离。该研究团队目前正在开发样品制备和前处理的自动化装置，以便于进行大型临床应用验证，并致力于进一步开发小型化便携式纳米孔传感器。

总体而言，该种检测方法具有很好的普适性，可以很容易的应用于生物标志物的检测，从而实现传染病和慢性疾病的诊断和治疗监控。

论文链接： https://doi.org/10.1016/j.nantod.2022.101515

审核编辑 ：李倩