如何评估一套显微镜系统 如何选择合适的成像设备

目前，可选用的显微镜设备和技术种类很多，本文主要是针对熟悉明场和荧光显微镜的读者。

资料来源：《Live Cell imaging A Laboratory Manual》

作者：Robert D. Goldman，Jason R. Swedlow

01#如何评估一套显微镜系统

在选择使用或购买哪种系统时，第一个要考虑的是哪种参数对实验来说是最重要的：速度、灵敏度、分辨率、多波长的识别能力或是细胞的活力，其中的很多参数之间是互相抵触的，需要折中考虑。第二个需要考虑的是使用此系统的目的是用于某些特定的检测，还是用于一般检测。一般来说，硬件选择灵活性大的系统更适用于特定检测，但组装和使用时有较高的技术要求。选择带有成熟软件的系统比较节省时间。无论选择什么类型的系统，都要先用自己的实验材料做测试。公司的销售代表做设备演示时必须根据实验使用的荧光染料和要求的放大倍数选择合适的滤光片、激发光源和物镜。除了感兴趣的生物材料外，还应该使用含不同染料的系列玻片，根据获得的量化数据用于对比不同的系统。

显微镜

首先要选择正置(从上方观察)还是倒置(从下方观察)显微镜。一般来说，观察活细胞，要获得高分辨率的三维图像时，倒置显微镜比较有优势。倒置显微镜的载物台使实验人员更便于对样品进行操作，也便于进行显微注射，并且便于使用环境可控培养箱。同时，倒置显微镜也为CCD相机的安装提供了更好的机械稳定性。

物镜的选择

物镜镜头及其使用模式的选择是影响图像质量的重要参数。选择适合封固剂的显微镜物镜对成像来说至关重要。显微镜物镜可在空气(通常是低放大倍数)、水浸(WI)或甘油溶液(80%)、硅油或常规物镜用油(折射率RI为1.50～1.534)中发挥作用。物镜是显微镜中最重要的部件，必须定期检查和清洗。物镜种类和作用如下：

02#高通量显微镜

应用于常规活细胞成像的大部分基本规则同样适用于哺乳动物活细胞的高容量筛选的显微操作。但是由于高通量的要求，高容量筛选成像系统必须满足一些额外的必要条件。大量商业化高容量筛选显微镜可供选择。对于基础研究环境的高通量成像系统最好不应只针对于特定的应用，而应该具有弹性化、模块化，能兼容基于一般荧光显微镜的许多其它不同检测。我们应特别考虑以下特征：

成像硬件的自动化

与样品制备过程一样高，高通量成像需高度自动化，包括焦点自动化鉴定，快门控制的光学曝光、马达控制荧光滤光片组、数据存储以及不同孔(点)之间的显微镜载物台移动。通常固定1~3个位点，其它位点根据一定的模式由计算机自动计算。基于成像和(或)硬件的自动聚焦一般是高容量筛选显微镜系统的瓶颈，因此当购买到一台高容量筛选仪器时，要特别关注此特征，尤其是在活体样品时成像的高容量筛选显微镜实验中，依赖一套恰当的自动聚焦检测策略对获得理想的时间分辨率是很重要的。自动聚焦有两种基本策略。第一是基于软件的自动对焦，即通过图像来确定聚焦质量(如在不同焦距层中确定最高变异度或优化图像中的聚焦物体数目)。此技术的优点是直接聚焦在感兴趣的结构上，使它们始终保持在焦点，而不管它们到细胞支持物的距离。然而，以图像为参照的自动聚焦程序通常很慢。在此方法中，在不同的焦平面要获得多个图像，而且在聚焦过程中活体样品曝光量很大，增加了样品光漂白速度，同时增加了光毒性。第二种策略是基于硬件进行的聚焦点鉴定，即通过近红外光反射来测量细胞支持物，如盖波片位置。图像收集的理想焦距位置可以通过使用者设定对自动检测出细胞支持物的位置进行抵消，也可以通过额外再加上基于图像的自动聚焦程序。硬件自动聚焦通常比图像聚焦鉴定快，显著降低了光漂白和光毒性。硬件自动聚焦的缺点是需要额外的硬件系统，而且在聚焦过程中只对细胞支持物聚焦。因此在整个实验过程中，只有样品位于细胞支持物同一位置时，才能对样品精确聚焦。硬件自动聚焦很少用于长时间观察，因为附着细胞经常部分解离，或者在有丝分裂过程中圆形化以及胚胎在发育过程中改变形态。

稳定性

在时程实验中，成像条件长时间的稳定性是定量成像分析的基本条件，只有当成像条件在短时间和长时间都能保持恒定时，在不同时间段内进行的实验才具有可比性，下述显微镜部件在高容量筛选显微镜实验中必须优化。

激发光源。对于定量分析，在整个实验过程中持续稳定的光强度是必要的。这可以通过使用非常稳定的光源得以证明，如发光二极管(LED)或者监测和调整灯温度和光强度的稳定光源。另有一选择是自动曝光，在不同实验中可保持成像强度的持续性。

自动曝光。此特征确保只有几个饱和像素并使用相机的动态范围。在高容量筛选实验中，重点确定最小和最大曝光时间，并将获取的灰度值转化为反映样品的荧光强度可比值。可通过校准选定的最小、最大强度的不同曝光时间和激发光强度而实现。

马达驱动的x-y显微镜载物台。在高容量筛选时程实验中，载物台在几百个位点之间重复移动。为保证每个x-y位点在时间进程中尽可能保持稳定以避免成像分析时的问题，应获得nm级高重复性准确性。

环境控制。温度波动可导致焦距漂移，造成可靠性成像困难，也影响细胞中很多生物过程；也就是说，在实验时间段内上下浮动1℃可引起明显变化。有不同类型的显微镜恒温箱，小型的只控制培养皿，大型的控制整个显微镜镜体。

聚焦稳定性。自动聚焦检测起始后，非常稳定的显微镜镜架和恒定温度足够保持焦距稳定性。如果检测期间聚焦稳定性不够或者细胞沿z轴方向在细胞支持物上上下移动，可以应用自动调焦系统来解决这个问题，但会降低时间分辨率、增加细胞毒性和光漂白，这在前面的内容中已有讨论。

兼容性

高通量筛选显微镜实验需要大量样本，产生庞大的数据组。高通量筛选显微镜设置应与样本制备和数据储存兼容，以便优化工作流程，并将获取的图像与初始样本(siRNA/cDNA/化合物)的图像分析结果联系起来。对于数据存储，常用文件格式不必为图像处理转变格式、图像收集过程中自动存入指定文件形式和连接到数据库的可能性都是重要的。

编辑：hfy