基于微流控技术的DNA甲基化分析方法研究进展综述

近年来，大量研究致力于开发DNA甲基化检测方法。检测方法的进步可以促进DNA甲基化在临床医学和科学研究方面的应用。微流控芯片能提供反应所需的条件和环境，可以被视作载体。微流控芯片上的分子分析由于其便携性、高通量、低成本和高效率的优点而受到广泛关注。近年来，科研人员开发出多种新型微流控芯片用于DNA甲基化分析并显示出明显优于传统方法的优势。

近期，来自天津大学精密测试技术及仪器全国重点实验室的研究人员在Nanotechnology and Precision Engineering期刊上发表题为“Advances in microfluidic-based DNA methylation analysis”的综述性文章，讨论了基于微流控技术的DNA甲基化检测方法，并描述了近年来取得的巨大进展。最后，研究人员总结了基于微流控技术的DNA甲基化分析方法的优势及其面临的挑战和前景。

DNA甲基化及其检测

DNA分子是细胞中遗传信息的载体分子之一，具有遗传效应的DNA分子被称为基因。经典的孟德尔遗传定律能较好地解释很多的遗传学现象。然而，经典的遗传学理论并不完备，能影响生命活动的遗传因素众多。随着多年来大量研究的不断深入，研究者们对遗传学有了越来越丰富的认知。

表观遗传学是遗传学的一个分支，主要研究在原始DNA序列没有改变的情况下发生的基因表达可遗传的变异。大量的研究表明，表观遗传与发育、衰老、疾病等生命过程相关。共价组蛋白修饰和DNA甲基化是表观遗传现象中被关注最多的分支。表观遗传修饰对染色质结构、基因表达、DNA和蛋白质相互作用、X染色体沉默和基因组印迹等方面均有着影响。

DNA甲基化作为表观遗传的现象之一，影响着遗传物质的表达。在真核细胞中，其一般发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上。CpG二核苷酸在蛋白质编码基因的启动子和第一外显子中的分布相对广泛，说明这种分布并非随机。CpG二核苷酸含量相对较高的区域称为CpG岛：大多数的蛋白质编码基因在启动子区域含有CpG岛，且其甲基化程度通常与基因的转录状态呈负相关。DNA甲基化在不同细胞、组织或个体间有着一定程度的差异。图1展示了一种基因表达调控的机制，涉及多种相互作用。DNMT蛋白可以主动改变DNA的甲基化状态，Tet蛋白也被发现对DNA甲基化具有调节作用。甲基化CpG可以通过甲基CpG结合域（MBD）蛋白来确定。结合后，组蛋白脱乙酰酶（HDAC）可以修饰到组蛋白尾部，从而去除乙酰化（AC）。在上述过程之后，染色质被压缩并且基因表达被抑制。甲基化修饰在染色质状态的调节中起着重要作用。



图1 DNA甲基化对基因表达的影响

DNA甲基化（如抑癌基因启动子CpG岛的高甲基化）被发现与癌症有很强的关系。许多的DNA甲基化的变化被证明与某种癌症的发生有着特异性的关联，并且在早期就能被检测到。一些研究证明了伴随癌症发生的基因组整体甲基化程度降低。而且不同种类的癌症有着各自特异性的甲基化修饰特征。该综述也提到了能同时筛查多种癌症的研究工作。因而胞嘧啶的甲基化修饰拥有着被用作癌症筛查或诊疗的标志物的极大的潜力。

一方面，由于缺乏大规模的验证和比较，DNA甲基化作为临床医学中疾病诊疗的依据仍然受到限制。另一方面，DNA甲基化在空间上的和时间上的异质性对检测手段提出了很高的要求。虽然已经开发出了不同的检测方法，但是现有的方法仍然存在不足，这很大程度上限制了甲基化检测被应用于临床医疗。因此，近些年来大量的研究聚焦在DNA甲基化的检测方法上。

已经开发出多种极具潜力的方法来检测甲基胞嘧啶，以满足不同情况下的检测要求，图2列出了一个较为典型的DNA甲基化检测流程。这些方法在灵敏度、成本、定量能力、分辨率、扫描范围和响应时间方面差异很大。而且，受制于工作流程的复杂性以及已经发现的与癌症的特定关系不足等因素，DNA甲基化在临床上的应用并没有达到预期。因此，DNA甲基化检测手段是一个关键因素。很多的研究聚焦在开发更为简便高效、低成本、高通量、高灵敏度的检测方法上。

图2 典型DNA甲基化分析的工作流程

基于微流控芯片的检测方法

DNA甲基化分析在临床医学和科学研究中的应用没有达到最初的预期，部分原因是分析方法的复杂性、成本、通量和效率。为了促进对DNA甲基化的理解，研究人员做出了多方面的努力。已经开发并报道了新的方法，近年来，基于微流控技术的分析优势逐渐凸显。微流控芯片方法被认为是有前景的，有望促进DNA甲基化分析的更多应用。目前已有的方法主要集中在样本前处理微流控芯片、产物检测微流控芯片、片上实验室等几个方面。微流控芯片可以被开发用于样本亚硫酸氢盐转化、核酸提取、目标细胞筛选富集。另外，在产物检测方面，微流控芯片可以结合电泳、表面等离子体共振、特异性扩增、数字式扩增、免疫分析等检测方法，可以实现高通量且低成本的检测。一种在微流控芯片上进行的数字式扩增和检测用于DNA甲基化分析的方法被认为是极具应用潜力的。研究人员已经设计、制造并验证了微阵列芯片，以并行地对每个目标分子进行分析。含有不同甲基化DNA的样品用亚硫酸氢盐试剂处理并纯化。制备后，将PCR混合物驱动到微腔中，并通过油分散以产生均匀的反应，从而可以数字询问甲基化状态。根据高分辨率熔体（HRM）分析的原理，超甲基化模板在转化和扩增后将表现出更高的熔融温度。甲基化状态是通过询问熔化温度来判断的。超低检测限已在该平台上得到确认，这说明了基于数字熔化的DNA甲基化分析的优势。

通过微流控技术可以实现高度集成的检测。芯片实验室或微全分析系统具有多种优点。可以在芯片实验室系统上以快速简单的方式进行各种临床或生化临床测试。在芯片上进行DNA甲基化分析的整个过程是一个非常有吸引力的前景。已经有很多相关研究致力于开发用于检测DNA甲基化的微流控芯片。

基于微流控芯片实现样本前处理

亚硫酸氢盐可用于将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不会受到影响。经过亚硫酸氢盐处理的甲基化胞嘧啶和非甲基化胞胞嘧啶在PCR扩增或测序中表现不同。胞嘧啶的甲基化修饰可以通过对比亚硫酸氢盐处理前后的序列来确定。然而，基于亚硫酸氢盐的分析的局限性之一是亚硫酸氢盐转化的复杂性。此外，在处理过程中，样品反复暴露在环境中并在容器之间转移，这可能导致污染和样品损失。亚硫酸氢盐转化过程中引入的污染和样品损失可能导致假阳性（阴性）、有偏差的定量或扩增抑制。为了解决这个问题，微流控芯片可以作为亚硫酸氢盐转化的优良载体。

MBD蛋白可以修饰到表面上以捕获目标分子，这很容易通过微流控技术实现。另外还可以从细胞筛选的角度促进DNA甲基化分析。靶细胞的选择和分离可以通过亲和富集来实现，可用于下游甲基化分析。当流体流过芯片时，目标细胞被捕获，从而实现富集。目标细胞可以被图案化在器件上的微结构捕获，因为它们与其他细胞具有不同的尺寸。该研究丰富了微流控技术在DNA甲基化分析中的应用，该设备与多个下游分析相匹配。需要进一步探索其与不同分析方法的耦合。

基于微流控芯片实现数字式检测

大多数方法的定量能力不足，也缺乏检测稀有DNA甲基化修饰的能力。异常的DNA甲基化是癌变组织中常见的表观遗传改变。然而，异常甲基化在正常组织中也可能较少出现，这有可能被用作癌症风险标志物。局限性在于正常组织中稀有甲基化的检测和精确定量可能超过传统的定量PCR的能力。数字PCR（Digital PCR，dPCR）技术在1999年被Vogelstein和Kinzler提出，被认为是第三代PCR技术。对于上述问题，基于数字PCR的DNA甲基化检测得到了极具竞争力的结果，而绝大多数的数字PCR方法都是基于微流控技术实现的。DNA甲基化检测被进一步地开发出了数字化的形式。稀有的甲基化等位基因可以被成功检测到并实现绝对定量。这种方法的意义在于它拥有检测到正常组织中的稀有的甲基化修饰的能力。如图3所示，微流控芯片可以以不同的方法帮助形成大量相互独立且稳定的液滴，包括大量微腔、油水相互作用等方法，这是微流控芯片的优势所在。



图3 基于数字熔解分析的DNA甲基化分析

基于微流控芯片实现“样本进-结果出”检测

研究人员致力于开发高度集成的检测方法，微流控技术提供了一条途径。具有多方面优势的芯片实验室或微全分析系统的检测模式可以以快速和简单的方式在芯片实验室系统上进行各种临床或生化临床测试。如图4所示，这种检测模式可以允许包括样本预处理在内的所有的检测步骤都在芯片上执行，无需过多的人为操作和干预。在芯片上进行DNA甲基化分析的整个过程具有重要意义。尽管芯片可以实现“样本输入-结果输出”检测，但目前已有的方法只能实现单次处理一个样本。

图4 “样本进-结果出”DNA甲基化检测微流控芯片

微流控芯片的优势

本文介绍并讨论了基于微流控的DNA甲基化分析的最新进展。近年来，DNA甲基化引起了人们越来越多的关注，微流控技术已经应用于DNA甲基化的一些研究中。许多传统方法已经在微流控芯片上实现。比较目前已报道的多种基于微流控芯片的DNA甲基化检测可以发现一些值得关注的特点。微流控芯片作为DNA甲基化检测的很好的载体，能较好地减少外部干扰，防止污染等因素对检测结果造成影响。尽管基于数字PCR的DNA甲基化分析的复杂性较为明显，但其高灵敏度是不可否认的，因此尝试开发更为简便高效的方法是有意义的。不同微流控器件之间的差异性较大，具体表现在灵敏度、定量能力、成本、检测限、响应时间等方面，而且在用途上也表现出了多样性，如用于样本前处理的微流控器件、基于不同检测原理的微流控器件、用于芯片实验室的微流控器件等。

图5 DNA甲基化检测方法

可以通过使用基于微流控的方法而不是传统的方法来减少分析所需的时间。多项研究利用微流控技术实现了DNA甲基化的快速分析。其次，通过创建具有用于dPCR扩增的多个腔室的微流控芯片，可以以非常高的精度和灵敏度来量化DNA甲基化异质性。开发了基于dPCR的多重DNA甲基化分析方法。第三，一些研究通过使用微流控芯片实现了灵敏的DNA甲基化分析，检测极限极低。微流控技术使单细胞DNA甲基化分析成为可能。最后，在微流控芯片上可以实现DNA的高效富集。总之，微流控技术为传统的DNA甲基化分析带来了多方面的改进。在未来，还有一些方面可以进一步探索。首先，应开发具有多功能的微流控系统，以应对不同的临床情况和需求。其次，预计将在微流控芯片上实现更多种类的传统技术，这可能产生与当前方法相比具有竞争力的结果。关键的芯片上步骤，包括但不限于基因组DNA提取、亚硫酸氢盐处理、扩增和检测，需要优化以提高基于微流控的方法的竞争力。最后，开发高集成度和高通量的微流控方法仍有待进一步探索。在临床诊断和治疗领域，肯定需要改进DNA甲基化分析方法。微流控技术提供了一种很有前途的方法，可以以灵敏、便携、快速、低成本和高通量的方式进行DNA甲基化分析。

论文链接： https://doi.org/10.1063/10.0023845



审核编辑：刘清