介绍一种用于绝对定量的微腔式数字PCR微流控芯片

本文提出一种微腔式数字PCR微流控芯片。作者将两层微结构背对背堆叠在一起使得在不改变芯片平面面积的情况下使腔室数量和试剂容量增加一倍，极大提升了检测灵敏度。同时将碳黑粉末混合到纯PDMS中以阻碍荧光从芯片两层之间的阳性腔通过，这使得芯片不同层微腔的荧光信号采集互不干扰。

图 1

如图 1 所示，该芯片由四层组成：顶层和底层透明玻璃片为扩增时防蒸发和信号收集窗口；中间两层为两个带有通道和反应腔的背对背PDMS层(见图2芯片浇筑)。中间两层结构采用相同的模具制造，并与入口/出口孔连接。

图 2

芯片PDMS层浇筑如图2所示。光刻流程过于简单，此处不再描述。

黑色PDMS的制作方法：将预混好的 10:1 PDMS 与碳黑粉末以0.8%的质量百分比混合。然后，将混合物在真空中脱气再以正常流程操作即可。既假设预混PDMS为100g，则需碳黑粉末为100g × 0.008 = 0.8g。

采用黑色PDMS的目的为阻碍荧光信号从芯片两层之间的阳性腔穿过。这使得芯片不同层微腔的荧光信号采集互不干扰。

图 3

图3所示为芯片PDMS结构层设计的一系列沿主通道两侧均匀分布的圆柱形反应腔放大图。

圆柱形反应腔直径为 87 µm，高度为 120 µm。主通道的高度为 50 µm，宽度为 60 µm。与圆柱形反应腔和主通道相连的分支通道的宽度和长度为25μm，高度为60μm。

芯片每一层包含 21,384 个独立的 0.71 nL 圆柱形反应腔，因此芯片可以输送超过 30 µL 的试剂。

图 4

芯片尺寸为35×20 mm，芯片实物如图4所示。

芯片操作流程如图5所示，依次完成芯片抽真空、试剂加载和分配过程。随后将芯片转移至平板PCR仪进行数字PCR检测。

图 5

作者对比了本文提出的单层结构和双层结构芯片的灵敏度。其中，一层芯片包含23,184个反应腔。

双层芯片与单层芯片在检测灵敏度和动态范围方面的比较如表1所示。

双层数字PCR芯片的检测限较低，因为腔室数量增加了一倍。由于腔室数量增加，检测上限也增加。因此，双层数字PCR芯片的动态范围是单层芯片的两倍以上。

审核编辑：刘清