体积生物打印技术面临的挑战

3D生物打印是以活体细胞和组织为原材料进行打印的新兴技术，科学家希望有朝一日可以通过这项技术从患者自己的细胞中培养器官，以此来解决器官供体短缺的问题。然而，打印活组织和细胞极其复杂，需要克服许多障碍才能实现。
2023年6月11日，南极熊获悉，UMC Utrecht公司最近开发了三种新的体积生物打印解决方案，它们将推动生物打印技术的发展，使其更具有临床应用价值。
体积生物打印技术的兴起
提及3D 生物打印，人们首先想到的是经典的塑料丝挤出式3D 打印方法，即熔融沉积建模（FDM）。这种方打印法这在过去 15 年左右变得流行，如今这种低成本打印机已被广泛使用。原则上，应该可以用不同种类的细胞代替塑料丝材，从而打印出生物功能组织。但要实现这一目标，就必须制造出高度精细和差异化的组织：即使是一立方毫米的器官组织也需要毛细血管，因此如果我们想创造我们需要的功能性组织，打印机的门槛需要很高才可以实现在临床规模上的应用。

随着生物墨水的发展，挤压式3D生物打印成为可能。新的喷嘴、营养墨水和预制支架使细胞更容易在这个过程中存活下来。通过同时使用各种墨水，可以沉积不同种类的细胞，从而创造出组织。但是，逐层打印仍然需要很长时间，多立方厘米的物体需要几个小时，细胞很可能在此过程中死亡。此外，挤压打印需要能够承受重力，因此墨水需要坚固，这意味着它们对细胞不是很友好。

为了克服这种缓慢且依赖于重力的过程，生物打印也提出了采用体积打印的模式。在此过程中，带有特殊凝胶的旋转小瓶暴露在激光下。激光照射到哪里，光敏凝胶就会迅速凝固。这意味着通过激光 3D 光重建，可以在几秒钟内创建多个立方厘米的复杂形状。现在，虽然这解决了速度和重力的问题，但它也有其自身的缺点。以这种方式，这些光敏凝胶只能包含悬浮的细胞，因此很难控制哪种类型的细胞最终会在哪里，以及目标区域内有多少细胞很难控制。而且由于凝胶很硬，细胞很难移动、伸展和相互流通，而这对于组织的形成甚至功能至关重要。

在乌得勒支再生医学中心，研究人员一直在努力克服这些挑战，下面讨论的论文分别解决了上述挑战的一部分。
在打印样品中创建生物功能区域

体积生物打印技术可以在几秒钟内打印出几厘米大小的物体，为细胞打印提供了多种可能性。该过程的速度与凝胶的细胞友好性相结合是巨大的优势。然而，当打印完成后，细胞可能不会准确地放置在需要它们的位置，也不可能改变凝胶来帮助细胞的发育、生长或特化以产生功能性组织。因此，克服这个障碍很重要：在我们的身体中，细胞知道去哪里和留在哪里，跟随它们在特定区域或组织中感知到的信号。

为打印凝胶添加功能
为了能够在初始打印过程后对打印品进行化学改性，研究人员研究了凝胶的孔隙率，以及其中与凝胶中其他分子结合的化合物。论文的第一作者 Marc Falandt 解释说：“通过这种技术，可以在几分钟内以高空间分辨率将生物分子移植到我们的打印结构上。首先，我们用体积打印机打印基于明胶的结构，然后通过将这些结构注入生物分子和光引发剂，我们可以在明胶结构内创建复杂的 3D 模型。这种方法使我们能够对希望捕获生物分子的位置进行三维控制，这在以前不可能的事情。”
通过给细胞一张化学图来帮助细胞找到它们的路
创新后的体积打印模式，可以将生长因子或生物活性蛋白“涂”在任何所需的 3D 形状中。例如，引导血管方向和形成的信号分子可以以这样一种方式放置，即它们创建一条轨迹，仅在 3D 打印对象内部需要的位置和时间吸引新血管。 然后，这些信号可以吸引正确的细胞，或帮助干细胞发挥其再生潜能。Falandt表示：“这项工作真正迈出了开发和表征智能材料的第一步，这些材料允许在三维空间中进行生化编辑。结合快速体积生物打印技术，这种方法非常有希望用于创建可以指导细胞行为和发育的生物制造支架。它可以让我们用我们的 3D 生物打印来密切模拟天然组织和器官的复杂生化环境。

用于打印电池的颗粒状凝胶

对于成功制造的组织，打印的细胞需要精心呵护，才能在成品中存活并茁壮成长。如果它们要形成一个功能性组织，它们就需要能够生长、移动并相互交流。

研究人员已经尝试了各种打印策略来解决这个问题，它们各有利弊。在 3D 挤压打印中，可以沉积多种类型的大量细胞，但这个过程需要很长时间，会对细胞造成机械应力并且依赖于重力——所有这些都不利于细胞的存活和功能。通过快速体积生物打印，速度和重力可能已经得到解决，但这里的挑战是细胞随机分布在树脂中且数量较少，并且由于最终打印由固体树脂组成，因此细胞无法正常移动和交流。
生物打印：LevatoLab，UMC Utrecht，根据 Creative Commons CC-BY 4.0 许可条款转载 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。139 版权所有 2019，Wiley-VCH 出版 (https:/ /doi.org/10.1101/2023.05.17.541111)创建一个颗粒状的微世界

为了解决这个问题，用于生物打印的材料必须提供允许细胞自组织和通信的环境。虽然这通常可以通过软水凝胶实现，但确保这些材料的高打印分辨率和形状保真度仍然是一个关键瓶颈，尤其是在使用传统的逐层制造技术时。 论文第一作者 Davide Ribezzi 探索了使用颗粒树脂来克服这些挑战，相关研究结果以题为“”的论文被发表在《bioRxiv》期刊上，撰稿人为Davide Ribezzi, MarièmeGueye, Sammy Florczak等人。
Ribezzi 说：“颗粒凝胶基本上是由紧密堆积在一起的凝胶微粒构成的。虽然每个微粒都具有与其散装水凝胶对应物相当的特性，但可以通过设计和定制填充的微凝胶颗粒以增加丰富的功能特性。因此，利用颗粒生物材料是一种很有前途的策略，可以解决打印过程中与大块细胞封装和材料可加工性相关的缺点。”

Bioprinting (3) en (4)：LevatoLab，UMC Utrecht，根据知识共享 CC-BY 4.0 许可条款转载 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)。139 版权所有 2019，出版商威利-VCH (https://doi.org/10.1002/adma.202300756)结合不同的打印策略

颗粒状树脂确实让研究人员能够将挤出和体积打印结合起来。使用挤压打印，某些细胞或其他化学物质可以专门沉积在树脂中。这种方法实现了体积打印速度与挤出打印精度之间的平衡。凝胶在打印喷嘴周围移动，就像奶油冻包围手指一样，因此细胞可以快速放置在多层中，而不必担心结构的强度。然后，体积打印可以通过在挤压单元周围创建和细化形状来完成该过程。
但这个过程并非没有挑战。Ribezzi声称：“处理生物材料总是需要大量的关注和精心的实验计划。但在我们的研究中，我们利用了微凝胶的热特性，可以精确调整机械和光学特性。这转化为嵌入细胞感知的可调刺激。然而，这种更高精度的调整在打印过程中需要更高程度的关注和精确度。”
更多生物活性
细胞实验证实，颗粒状树脂在打印后具有更多的生物活性，大大优于固体凝胶。在被打印到树脂中后的八天内，干细胞能够扩散得更多，内皮细胞产生更多的连接，神经元样细胞之间的连接也更多。 Ribezzi 进一步评论说：“对于未来的研究，我们设想了从不同材料中获得的微凝胶的混合甚至局部图案化。它将使我们能够创建具有独特特性的复合结构，例如药物的生物活性载体。这些工具将提高组织功能，并为组织工程、再生医学和工程生物材料的新兴领域开辟更多机会。”



功能性血管的生物打印技术
体积生物打印是一种快速技术，可使细胞在打印过程中存活下来。然而，由于这种类型的打印是在对细胞友好的凝胶中完成的，因此产生的打印品在结构上不是很健全。对于必须能够承受高压和弯曲的打印血管来说，这是一个问题。出于这个原因，研究人员开始尝试体积生物打印和熔化电写的整合。
熔体电写是一种高度精确的 3D 打印类型，它通过引导熔融（可生物降解）塑料的细丝来工作。它能够生产出机械强度高且能够承受力的复杂支架。这里的缺点是它们不能直接在其中打印电池，因为涉及高温。因此，这里使用体积生物打印是为了实现将载有细胞的凝胶固化到支架上。

整合电子直写和体积打印技术这一过程从使用熔体电写创建管状支架开始。然后将其浸入装有光敏凝胶的小瓶中，并放置在体积生物打印机中。原则上，打印机的激光可以选择性地固化位于支架内、支架上和/或周围的凝胶。 本论文的第一作者 Gabriël Größbacher 说：“为了做到这一点，我们必须将支架放在小瓶的正中央，任何偏离中心的地方都意味着体积打印会被抵消。我们通过在安装在小瓶上的心轴上打印支架，设法将其完美居中。” 在这项研究中，Größbacher 及其同事测试了不同厚度的支架。最后，他们还测试了生物打印凝胶的各种放置方式。这些凝胶可以放置在支架的内侧、脚手架本身内部或外部。通过使用两种不同标记的干细胞，该团队能够打印出具有两层干细胞的原理验证血管，并在中心种植上皮细胞以覆盖血管腔。从试管到功能性容器这项设计还可以允许在打印品的侧面打孔，从而有可能控制血管的渗透性，使血液发挥其功能。最后，研究人员还创造了更复杂的结构，如分叉血管，甚至是带有静脉瓣膜的血管，这些静脉瓣膜可维持单向流动。 Größbacher表示：“这是对原理研究的证明。我们现在需要做的是用作为真实血管一部分的功能细胞替换干细胞。这意味着在上皮细胞周围添加肌肉细胞和纤维组织。我们现在的目标是打印功能性血管。” 虽然这些创新为推动生物打印提供了有趣的选择，但如果它们可以结合和扩展，效果会最好。研究小组组长 Riccardo Levato 表示：“能够将生物活性分子打印成使用颗粒状凝胶的打印品，这意味着细胞可以更好地利用分子信息，并与邻近的细胞一起生长发育成组织。
责任编辑：彭菁