光片荧光显微镜的优点 光片显微镜中的偏振和相干控制

光片荧光显微镜的优点

光片荧光显微镜(LSFM)是一种可以对活体标本进行快速且无光毒性3D观测的强大显微成像技术。LSFM技术将宽场成像的速度与适度的光学切片和低光漂白特点相结合，因此也被称为选择性平面照明显微镜(SPIM)，或简称为“光片”。SPIM或LSFM共同的定义特征是从侧面对焦平面进行平面照明，在任何给定时间，仅对样品的一小部分进行照明，因此与宽场辐射荧光相比，可以最大限度地减少光损伤并提供改善信噪比的光学切片。此外由于图像是以宽场(2D平行)方式收集的，因此光片成像比一次仅检测一个像素的点扫描共聚焦显微镜快得多。

由于三个关键特性，光片荧光显微镜正成为体积成像最流行的技术之一：

1.激发点被限制在焦平面附近，光损伤被最小化，生物可以存活更长的时间;

2.容易获得良好的光学切片，通常接近共聚焦显微镜;

3.采集速度非常快，比传统的共聚焦显微镜快几个数量级。

从本质上讲，光片显微镜通常基于荧光技术，一般来说，研究中的样品需要正确标记才能成像。使用弹性散射光可以生成未标记样本的图像，但目前主要的障碍是这些图像通常受到散斑的影响。为了解决这个不便，Pablo Loza-Alvarez, Omar Alarte, David Merino of ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques with Diego Battista and Giannis Zacharakis of Foundation for Research and Technology-Hellas使用来自样本的弹性散射光来生成图像，以避免对样品的标记。他们使用了低时间相干的超连续谱激光光源作为一种候选光源，以减少散射光在光片显微镜图像中固有的散斑。

在这项工作中，他们提出了一种基于光片的新型光学装置，该装置采用了三种方法来处理弹性散射图像带来的散斑，分别是偏振滤波、降低激发光源的时间相干性和降低光片的空间相干性，这些策略可以在不依赖荧光标记的前提下使具有挑战性的生物样品结构特征的原始光片弹性散射成像成为可能。

光片显微镜中的偏振和相干控制

在该实验中，弹性散射光片显微镜的主要部件是来自西班牙FYLA公司的超连续谱光纤激光器，它发出从可见光到红外光的宽带光谱。该光源具有非常宽的光谱带宽，同时，它呈现出非常低的时间相干性，这对于减少图像中的散斑效应都是非常重要的。对FYLA白色激光选择500至700nm(140nm FWHM)的波段用于光片荧光显微镜，可以提供较低的时间相干性以降低散斑对比度。

图1：弹性散射光片显微镜中偏振和相干控制的实验装置示意图。图(a)：光片照明光路由一对发射波长分别为515nm和638nm的二极管激光器和一个超连续谱激光器(SCL)组成。激光束在进入显微镜之前被放大10倍。P1是一个半波片(HWP)，它在通过柱面透镜(CL)、振镜(GM)和照明物镜(OBJill)之前控制三束光束的偏振。GM扫描OBJill瞳孔处的光束，在样品平面上产生一个旋转的光片。样品保存在装满水的定制浸没室(C)中。检测系统由一个0.5N.A.物镜(OBJdet)、一个200mm管透镜(总放大倍率为20X)和一个偏振器(P2)组成。图(b)：FYLA激光器在500-700nm(140nmFWHM)波段的发射光谱，红色垂直波段为红色二极管激光器的带宽(1.2nm)。图(c)：靠近照明物镜(OBJill)的光学设置的细节，说明了旋转光片方法。FYLA激光片围绕位于OBJill工作距离(WD)的轴旋转，即位于样品平面的中心

FYLA超连续谱激光是否在LSFM中实现了无标记的结构成像?

以上实验结果表明，与其他光谱带宽较窄的光源相比，Iceblink超连续谱光源对LSM图像的散斑贡献较低，从而可以总结出弹性散射光片显微镜是一种适用于无标记结构成像的新型光片成像方式。为了提高此配置中的成像质量，他们还建议实施：1、偏振控制，可实现对比度选择性并消除基板背景。2、时间和空间相干性降低，可以从散斑噪声中提取内源性内在对比度。

以这种方式实施，弹性散射光片成像为标准LSFM实验提供了有用的补充结构信息，如MCTS样品所示。此外，它有可能类似于组织切片但以非破坏性方式提供样品的相关形态学细节。最后，弹性散射光片显微镜是一种很有前途的技术，可以进行新的有趣的实验，例如，在受低信噪比限制的应用中替代LSFM，例如功能成像或快速体积结构成像。

图2：使用弹性散射光片显微镜系统获得的线虫头部图像。a)使用FYLA光源的蠕虫头部3D图像堆栈的最大强度投影(图像尺寸为230×110μm)。b)是使用FYLA Iceblink光源获得的(a)平面之一的细节(图像为80×40μm)。c)是使用488nmCW二极管激光器获得的与(b)相同的图像(图像为80×40μm)

来源文献：

Enhanced Light Sheet Elastic Scattering Microscopy by Using a Supercontinuum Laser.

Diego Di Battista, David Merino, Giannis Zacharakis, Pablo Loza-Alvarez and Omar E. Olarte.

关于超连续激光器

超连续谱激光器(Supercontinuum Sources)又称白光激光器。2000年，RANKA等报道了在光子晶体光纤中产生2倍频程的超连续谱，超连续谱的产生为非线性光纤光学领域的研究注入了新的活力。利用光子晶体光纤产生超连续谱是一种新型的光源，它具有高的输出功率、平坦的宽带光谱、高度的空间相干性(聚焦)等特性，能极大提高信噪比、减小测量时问以及加宽光谱测量范围。光纤超连续谱光源可应用在光纤衰减测量、干涉测量仪、光相十摄影术、光谱学分析、生物成像、光学频率梳等领域。

关于Iceblink超连续激光器

Iceblink是一款覆盖450- 2300nm光谱范围的超连续光纤激光器，具有超过1W的平均功率和卓越的稳定性(0.5%标准偏差)。它是一种用途广泛的白光光源，在科学和工业领域有着广泛的应用，典型应用包括材料表征、VIS、NIR和IR光谱、单分子光谱和荧光激发的吸收/透射测量。 Iceblink的空间相干性和宽光谱范围使其成为传统灯源、单波长激光器、LED和ASE光源的绝佳替代品。

图3：Iceblink超连续激光器实物图

规格指标：

图4：Iceblink超连续激光器典型光谱

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