多光子显微镜成像技术：双光子显微镜角膜成像

角膜提供了眼睛的大部分折射能力,由5层组成(图1),从外到内依次是上皮层,鲍曼层、基质、角膜后弹力层(间质膜)、内皮层。

图1 角膜的组织学结构

上皮层负责阻挡异物落入角膜,厚约50μm,由三种细胞构成,从外到内依次是表层细胞、翼细胞和基底细胞。只有基底细胞可进行有丝分裂和分化,基底细胞的补充是由从角膜边缘的干细胞完成的。翼细胞由基底细胞分化而来,处于中度分化状态,形状像羽翼。表层细胞完全分化,不断脱落。基底细胞下方有一层基底膜,由基底细胞分泌而来。

鲍曼层是一层无细胞结构的薄膜,厚8～12μm,主要成分为杂乱交织的胶原蛋白纤维。

基质厚约450μm,占角膜厚度的90%,是维持角膜形状、强度和透明性的主力,由规则分布的胶原蛋白纤维、基质细胞和基质外成分构成。基质结构中,长度和直径均一的胶原蛋白平行分布,构成片晶结构,多个片晶制成起整个基质。基质细胞通过合成胶原蛋白和基质外成分对基质进行保养和再生。基质部分通过水合作用对角膜的含水量进行调控。

角膜后弹力层(间质膜)是内皮层的基底,由胶原分子和糖蛋白构成,厚度随年龄增大而增长,新生儿厚约3～5μm,老年人厚约10～15μm。

内皮层厚5μm,由单层多角细胞构成,代谢水平高,负责抽运水分子,调控角膜的水合作用。

角膜的生理学基础主要介绍营养供给与氧气供给。角膜获得营养物质是通过眼房水和边缘的毛细血管获得,而氧气是通过泪膜中的扩散获得。角膜在睁眼时有氧呼吸产生ATP供能,睡眠时无氧呼吸产生ATP供能。当角膜发生病变时会影响角膜的代谢方式。

传统成像方式有裂隙灯显微成像,共焦距显微成像和光学相干断层扫描成像(OCT)三种。裂隙灯显微成像由双目望远镜和长、宽、入射角可调的光源组成,最早应用于角膜成像中,但无法获得细胞层面的信息。共焦距显微成像使用小孔滤去焦距外的信号,可获得细胞解剖学和密度信息,但无法获得代谢信息。OCT成像速度快,可获得角膜层次结构信息,成像深度大,但无法获得代谢信息。

双光子显微成像成像深度大,分辨率在亚细胞水平,可获得细胞代谢和基质结构的信息。细胞代谢信息可通过对细胞内源性分子(如NAD(P)H和FAD)荧光成像获得(图2,其中红色为NAD(P)H,绿色为FAD),基质结构信息可通过胶原蛋白纤维的二次谐波产生获得。

图2 双光子荧光对角膜细胞结构成像 [1]

内源分子的种类可通过荧光的光谱、强度、荧光寿命进行分辨,双光子成像有双光子荧光强度成像、双光子荧光寿命成像和二次谐波产生成像三种。在强度成像中,同种分子不同的氧化还原状态信号不同,反应了新陈代谢信息。在荧光寿命成像中,同种分子处在不同微环境时所发荧光的持续时间不同,据此可判断其是否与蛋白质结合,从而判断代谢状态。二次谐波成像中,近红外激光可激发胶原蛋白产生二次谐波,获得基质层结构信息。

双光子显微成像系统由钛宝石近红外光源、3维扫描组块,光展宽器、衰减器、显微物镜和光电倍增管构成,有5D激光扫描显微镜(图3)和多光子断层扫描仪MPTflex两种装置。

图3 双光子显微成像设备示意图 (a) 5D激光扫描显微镜 (c)MPTflex [1]

图4使用多光子断层扫描仪MPTflex 获得,展示了线粒体较少的上皮层表层细胞(图4(a),图4(b)),线粒体中等的翼细胞(图4(c)),线粒体较多且集中在细胞核附近的基底细胞(图4(d)),鲍曼层存在基底细胞(图4(e),图4(f)的红色)和胶原蛋白(绿色),基质层存在丰富的胶原蛋白(图4(g),图4(h)的绿色)和少量基质细胞(箭头),角膜后弹力层内源荧光信号强(图4(i)),但胶原蛋白的无规则分布阻碍了二次谐波产生,内皮层线粒体密集(图4(j))。

图4 多光子断层扫描仪MPTflex对细胞不同层次形态成像 [1]

而使用二次谐波成像可获得基质层胶原蛋白结构(图5)。

图5 二次谐波对基质部分胶原纤维的成像 [1]

双光子成像可对角膜上皮层进行形态学和新陈代谢分析(图6),来进行角膜移植前的评估。其中主要评估的是角膜内皮层的细胞密度状态,除此之外还可以通过代谢状态分析内皮层病理学状态。双光子成像还可以分辨角膜疾病,图7为角膜上皮层成像,其中(a)为正常角膜,(b)为圆锥形角膜,(c)为棘阿米巴角膜炎,细胞形态有明显变化。图8为无病理及患有圆锥角膜及棘阿米巴角膜炎角膜基质的二次谐波成像,(a)为正常角膜,(b)为圆锥形角膜,(c)为棘阿米巴角膜炎,病理组织的二倍频信号异于正常组织。

图6 多光子显微镜对角膜进行角膜移植前评估 [1]

图7 无病理组织(a),圆锥角膜症组织(b)及棘阿米巴角膜炎组织(c)的双光子形态学成像 [1]

图8 无病理组织(a),圆锥角膜症组织(b)及棘阿米巴角膜炎组织(c)的二倍频成像 [1]

眼角膜病变是致盲的重要原因,传统成像方法(如裂隙灯显微成像、共焦距显微成像、光学相干断层扫描成像)无法对活体角膜细胞成像,获得有关细胞的代谢水平和角膜基质组织结构的信息。双光子成像通过激发内源特异性荧光和二次谐波,获得角膜细胞形态、新陈代谢状况和基质结构的信息,从而可以在角膜移植和病理诊断中发挥重要作用。

审核编辑：符乾江