新型高效抗反射金属材料实现激光解吸附离子化质谱分析

质谱成像是一种结合质谱分析的分子成像技术，可以同时获得分子的空间分布信息和化学结构信息，在生物标记物的靶向分析以及疾病标记物的发现中有着重要的意义。日前，清华大学精密仪器系欧阳证、马潇潇教授课题组与材料学院钟毓霖教授课题组合作，利用以铜为基底的微纳米复合锥体阵列抗反射材料（对紫外辐射平均吸收率高达97％），实现了无需基质的激光解吸附离子化质谱分析。

研究背景

基质辅助激光解吸附离子化（matrix-assisted laser desorption/ionization， MALDI）质谱技术使用紫外激光扫描样品表面获得质谱信息，是目前应用最广泛的质谱成像技术，尤其适合生物大分子和高聚物的分析。该技术是采用短的脉冲激光（1-10ns）使样品分子离子化后进入质谱仪分析。

但传统MALDI质谱成像需要在组织切片表面均匀喷涂小分子基质，不仅流程繁琐耗时，还可能改变分析物在组织中的分布。此外，基质使用及喷涂不均匀会造成低质量端背景干扰、成像重现性差、空间分辨率低等一系列问题。

近些年来，研究人员开发了一系列固体基底材料替代小分子基质实现激光解吸附离子化（laser desorption/ionization， LDI），主要包括纳米材料、纳米结构和纳米粒子等。目前，大部分LDI基底材料仍存在制备过程复杂、使用寿命短、易被污染、离子化效率低等问题，发展一种高效耐用的基底材料是提高LDI质谱检测实用性和有效性的关键。

研究进展

为解决上述问题，清华大学精密仪器系欧阳证教授和马潇潇教授团队近年来致力于发展无基质激光解吸附离子化（LDI）质谱成像技术。通过与清华大学材料学院钟敏霖教授合作，利用一种新型高效抗反射（anti-reflection， AR）金属材料做载样基底，可在不使用基质化合物的情况下实现样品分子的激光解吸附和离子化（图1），提高分析速度，避免背景干扰。

该材料通过一步超快激光刻蚀在铜表面原位加工制成（图1（b）），具有周期性微米级锥孔阵列结构和表面覆盖的大量纳米颗粒结构（图1（c）），可有效束缚和吸收入射光，对紫外辐射的平均吸收率高达97％。因此，AR材料可以有效捕获LDI紫外激光（355 nm）并将其转换成热能，促进分析物发生“局部爆炸”，实现解吸附和后续的离子化过程。该抗反射材料结构稳定，清洗后可重复使用200——400次。

图1 （a） 使用抗反射材料做LDI基底检测酵母细胞样本的原理示意图，箭头表示光捕获原理

图1（b）抗反射材料（黑色区域为抗反射材料）; （c）抗反射材料扫描电镜图; （d） 酵母细胞的AR-LDI质谱图，酵母细胞直接滴加至材料表面，可检测到多种代谢物离子峰

2018年，该团队在Research上发表了基于抗反射材料的激光解吸附离子化质谱检测方法（Research， 2018， DOI： 10.1155/2018/5439729）。采用铜微纳复合锥体阵列抗反射材料（对紫外辐射平均吸收率高达97％）为基底，实现了无需基质的激光解吸附离子化，以及对糖类、氨基酸、药物分子等生物小分子的高灵敏度检测和对洋葱提取液和酵母细胞中代谢物的快速直接质谱检测。

然而，铜材料的高导热性会造成局部热量的扩散，并降低质谱检测灵敏度。为减少热量扩散，该团队采用热导率更低的不锈钢，并在表面修饰聚多巴胺（polydopamine，PDA）制备不锈钢抗反射复合材料，进一步提高了质谱分析的灵敏度和生物分析的兼容性。PDA具有合成方便、稳定、可修饰到多种表面、良好的生物相容性等优点。同时，PDA在300 nm附近的强光吸收可有效增强激光解吸离子化效率。质谱分析和成像结果表明，聚多巴胺-不锈钢抗反射复合材料具有良好的解吸附离子化特性，可用于生物组织中甘油三酯（TAG）、甘油二酯（DAG）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、鞘磷脂（SM）、胆固醇酯（CE）以及溶血磷脂酰胆碱（Lyso PC）的高效质谱检测。对鼠脑组织切片的高分辨率（50 μm）质谱成像同时获得了20余种磷脂分子的空间分布和结构信息，表明磷脂分子在小鼠大脑灰质区、白质区和胼胝体呈现截然不同的区域和丰度分布（图2）。

图2. （a）不锈钢抗反射材料（AR-SS）和聚多巴胺修饰的不锈钢抗反射材料（PDA-AR-SS）的扫描电镜图。（b）使用PDA-AR-SS做基底实现LDI质谱成像的原理示意图；（c）使用PDA-AR-SS对鼠脑组织切片的质谱成像结果。

清华团队利用该方法研究了肥胖小鼠（ob/ob）肝脏组织中的脂类含量和分布（图2）。实验结果表明，相比正常小鼠，肥胖小鼠肝组织中的甘油三酯含量显著增加，并呈离散状分布；而正常小鼠肝脏组织中PC、PE等分子的含量更高。以上结果表明聚多巴胺-不锈钢微纳复合抗反射材料可实现高空间分辨率质谱成像，无需在生物组织上喷覆基质，从而大大简化了分析流程，避免了基质背景干扰，且基底材料清洗后可反复使用200次以上，对推动质谱成像在疾病诊断等领域的应用具有重要意义。

图3. 使用PDA-AR-SS做基底，对肥胖小鼠和正常小鼠肝脏组织的LDI质谱成像。

上述研究成果近期发表在ACS Applied Materials & Interfaces 上（ACS Appl. Mater. Interfaces 2019， 11， 49， 46140-46148， DOI： 10.1021/acsami.9b16260）。

未来展望

该抗反射金属材料可用于多种生物分子的高灵敏度检测，为激光解吸附和离子化质谱提供了一种通用、高效、快速的软离子化技术，可用于大量生物样品的高通量分析。之后，该团队又通过对该材料表面的多巴胺修饰，改善了材料的生物相容性及质谱检测灵敏度，且避免了常规质谱成像的繁琐、耗时的基质喷涂流程，大大简化质谱成像流程。

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