DSP助力同质癌细胞进行药物治疗后的克隆命运研究

即使在基因相同的癌细胞中，对治疗的抵抗也经常出现在这些细胞的一小部分中。初始群体中稀有单个细胞的分子差异使某些细胞对治疗产生耐药性；然而，人们对耐药结果的变异性知之甚少。在此研究中，研究者开发并应用 FateMap，这是一个将 DNA 条形码与单细胞 RNA 测序相结合的框架，以揭示数十万接受抗癌治疗的克隆的命运。

研究者发现，单细胞来源的癌细胞中出现的耐药克隆在分子、形态和功能上都具有不同的耐药类型。这些耐药类型很大程度上是由添加药物之前细胞之间的分子差异决定的，而不是由外在因素决定的。药物剂量和类型的变化可以改变初始细胞的耐药类型，导致某些耐药类型的产生和消除。来自患者的样本显示了临床背景下这些耐药类型存在的证据。他们观察到几种单细胞来源的癌细胞系和用多种药物治疗的细胞类型的耐药类型的多样性。由于内在细胞状态的可变性而导致的耐药类型的多样性可能是对外部线索反应的一般特征。

01 技术路线

02 研究结果

1、药物治疗后出现了不同的命运

研究者重点关注 BRAFV600E 突变黑色素瘤，其中使用靶向疗法维莫非尼治疗单细胞衍生细胞可导致稀有（千分之一或更少）细胞存活，这些细胞会增殖形成耐药集落。研究者对单个组织培养皿中所有抗性集落的混合物进行了 scRNA-seq，发现抗性类型的基因表达谱表现出广泛的多样性。

为了同时确定每个细胞的转录谱和克隆起源，研究者开发了 FateMap，这是一种使用转录 DNA 条形码同时识别来自数千个耐药细胞的克隆的方法。首先，慢病毒条形码整合到未经治疗的细胞的 DNA 中。凭借庞大的条形码库复杂性（大约 5900 万个独特的条形码）和较低的 MOI，可以对数千个细胞进行独特的条形码标记并通过分选进行富集。研究者将带有条形码的细胞暴露于维莫非尼，收集耐药群体，进行scRNA-seq，并通过以链接克隆条形码和细胞标识符的方式选择性扩增和测序cDNA文库，提取每个细胞的FateMap克隆条形码。结果显示抗性细胞存在明显的转录异质性。

图1 FateMap揭示了克隆间命运类型多样性是由单个细胞在治疗过程中产生的

2、耐药类型功能多样

接下来研究者测试了转录上不同的抗性克隆是否具有不同的表型特性。研究者计算了不同耐药类型的每个克隆的细胞数量。结果显示不同的耐药类型具有不同的增殖能力。研究者也发现，不同的抗性克隆在胶原基质中有明显不同的侵袭区域。研究者将这种形态和侵袭性的变化与特定的转录谱联系起来。他们从大量RNA-seq中鉴定出不同形态类型之间差异表达的基因，并使用这些基因集从FateMap中将形态学映射到单细胞簇。因此，克隆间基因表达的差异对应着在增殖、形态和侵袭性方面的功能差异。

图2 克隆间基因表达的差异对应于形态、增殖和侵袭性的差异

3、不同的耐药类型在癌症中发生

研究者在其他癌细胞系中寻找耐药类型的多样性。另一个患者来源的单细胞黑色素瘤细胞系(BRAFV600E WM983B E9-C6)也在维莫拉非尼治疗下显示了耐药克隆之间的形态和增殖差异。FateMap揭示了WM989 A6-G3细胞中许多相同的转录特征和增殖差异(补充数据)。

4、耐药类型出现在患者身上

研究者质疑这些耐药类型是否也出现在患者身上，其中微环境(包括免疫系统)和空间背景是因素。他们从4名在靶向治疗后复发的患者身上获得了肿瘤组织样本。对于其中两个人，他们也有他们接受治疗前的匹配肿瘤样本。对肿瘤进行多次穿孔活检。他们使用GeoMx DSP，从每次穿孔活检中选择由73到1,390个细胞组成的多个感兴趣区(ROI)，并通过RNA-seq进行图谱分析(所有样本中有93个区域)。结果显示，关键耐药类型标记物在耐药肿瘤贴片中的表达存在广泛的差异性，这表明患者体内同一肿瘤的不同区域可能含有不同比例的FateMap。在接受靶向治疗之前，他们在患者匹配的肿瘤样本的邻近区域发现了类似的预先存在的可变性，这表明存在一定程度的预先存在的异质性。此外，他们发现靶向治疗后免疫浸润的异质性。总之，这些结果为患者样本中存在多种耐药类型提供了强有力的证据。

图3 空间转录组分析证实，患者在靶向治疗后出现耐药命运类型

5、由初始条件预先决定的抵抗命运

研究者质疑耐药克隆的转录和表型变异是否是药物暴露前细胞分子表达状态的内在差异的结果。或者，抗性类型可以由外部决定。“同卵双胞胎”分析与FateMap相结合，使他们能够区分这些可能性。简而言之，在独特的条形码细胞上，让它们分裂几次，然后将群体分成两个相等的分裂群体 A 和 B，这样大多数带有条形码的克隆（超过 90%）作为“双胞胎”存在于每组中。然后他们应用维莫非尼并对两个分割群体进行 FateMap。如果细胞的抗性类型是本质上决定的，那么它的双胞胎将共享相同的类型。基因组 DNA (gDNA) 的纯条形码测序证实了群体之间条形码的强烈重叠，表明耐药潜力总体上是本质上决定的。

接下来，他们测试了克隆所采用的特定抗性类型是否类似地由预抗性细胞的初始状态而不是外部因素预先确定。结果显示，双胞胎具有相似的转录谱。研究者也制定了一个称为“混合系数”的指标（方法）表明，采用不同的转录和表型类型是由药物暴露前细胞的内在分子状态决定的，环境因素对类型结果几乎没有影响。

图4 细胞在接受治疗后注定会有不同的耐药性

6、改变药物剂量导致命运转换

耐药性在很大程度上取决于所用药物的浓度。研究者探索了如果使用 FateMap 在两个分裂群体中使用不同的药物浓度（每个群体都接受不同浓度的药物），耐药类型的整体会如何变化。在低剂量治疗的小鼠中，耐药肿瘤生长相对较快。FateMap 可以通过在条形码后分割群体并将双胞胎中的一个置于低剂量环境中，将另一个置于高剂量环境中来区分这些可能性。接下来他们探讨了抗性克隆的多样性在低剂量和高剂量药物之间如何变化。尽管低剂量和高剂量之间的耐药频率存在广泛变化，但两个剂量之间的许多转录类型是相同的。然而，也存在许多差异。

图5 改变治疗剂量会导致刻板的耐药命运类型转换和转录谱的改变

03 研究结论

研究者专注于表征单细胞来源的癌细胞对抗癌疗法的耐药类型。细胞系分析显示即使在克隆系中也存在令人惊讶的变异性，这可能反映了克隆记忆。值得注意的是，这种变异性可以驱动许多癌症表型，包括治疗耐药性、生长、致瘤性和转移。FateMap 可以揭示多种生物过程中新兴类型的多样性，包括干细胞重编程和定向分化，并识别它们的潜在起源。

审核编辑：刘清