上海交大科研团队研发蜂巢芯片，用于非洲猪瘟核酸检测

近日，爱思唯尔（Elsevier）旗下著名分析化学期刊Analytica Chimica Acta（IF：5.977）在线发表了上海交通大学系统生物医学研究院陶生策团队的最新研究成果“Multiplex and Visual Detection of African Swine Fever Virus (ASFV) based on Hive-Chip and Direct Loop-mediated Isothermal Amplification”。该研究基于“蜂巢芯片（Hive-Chip）”和“LAMP直扩法”提出了针对非洲猪瘟病毒多基因并行检测的全流程方案，具有无需核酸提取、不依赖精密仪器及避免因病毒的单个基因突变引起的假阴性问题，且灵敏度高、特异性强、可视化检测以及适用于POCT（Point of Care Testing，即时检测/床旁检测）等优点。本研究也已申请相关专利“一种靶标基因组合在非洲猪瘟病毒检测中的应用及试剂盒”。

非洲猪瘟 (African swine fever, ASF) 是由非洲猪瘟病毒 (African swine fever virus, ASFV) 引起的猪的一种急性、高度传染性和致死性的疾病，死亡率高达100%。截止到2020年3月5日，中国已有32个省份共爆发165起非瘟疫情，累计扑杀生猪1,193,000头，给中国乃至全世界的养猪业带来巨大的威胁。ASFV是一种呈二十面体对称的dsDNA病毒，基因组巨大（170~190 kb），由于其复杂的基因组成和高度变异性，已根据同源性较高的编码衣壳蛋白VP72的基因B646L被划分为24个基因型。目前，ASF尚无有效的治疗方式和疫苗，扑杀和焚烧是防止疫情蔓延最有效的手段，因此快速、准确地检测ASFV至关重要。

现有ASFV核酸检测方法主要存在两个问题：只针对ASFV单基因进行检测，依赖于复杂精密的仪器。针对问题一，本研究首先根据ASFV序列比对结果获得了较保守的5个基因（B646L、B962L、C717R、D1133L、G1340L），并针对每个基因设计4套LAMP（Loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增）引物，通过In-tube LAMP和On-Chip LAMP进行了有效性（Validity）、特异性（Specificity）和灵敏度（Sensitivity）测试，得到了一组能够用于ASFV多基因检测的LAMP引物，有效避免因单个基因突变而造成的假阴性结果，提高阳性检出率；针对问题二，本研究采用物理隔离的策略，将10根毛细管通过PDMS（聚二甲基硅氧烷）基座集成起来形成酷似蜂窝煤的“蜂巢芯片”，并进行疏水修饰。每根毛细管内固定不同基因所对应的LAMP引物，借助加样接头（Adaptor）和毛细现象，使样本同时分散到各个毛细管内，进行等温扩增和荧光检测，实现了一次反应同时检测多个基因，并且LAMP直扩法免去了核酸提取步骤。

基于此，团队成员分别对猪血模拟样本和ASFV基因组DNA样本成功进行了检测，并以其他猪病毒基因组DNA样本（包括猪伪狂犬病病毒PRV、猪圆环病毒2型PCV2以及猪细小病毒PPV）进行了特异性检测。为了进一步证明ASFV多基因检测的必要性，团队成员将现有ASFV菌株（GenBank: EF121429.1, MH025920.1, KM111295.1，MH025919.1）存在的点突变引入B646L基因质粒中，芯片检测结果发现该位点（即1号毛细管）呈阴性，而其他毛细管呈阳性，表明如果此时只检测B646L基因，就会出现假阴性结果。

综上，本研究针对ASFV开发了通用的多重核酸检测平台，特别是针对易变的病原体（例如新冠病毒），通过一次反应检测多个基因，既能实现多重可视化检测，又不依赖精密仪器和专业操作，适合口岸检验检疫和现场即时检测。

本研究的第一作者为上海交通大学2017级博士研究生朱元首，通讯作者为上海交通大学陶生策研究员和北京博奥生物张岩博士。

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