一种基于微喷头的异质螺旋凝胶微球的三维打印工艺

摘要：“一花一世界、一叶一菩提”蕴含的是东方的世界观，“There is plenty of room at the bottom”是科学家费曼对微纳制造能力的畅想。这几年我们一直在想，是否有可能在一个微小空间里构造出复杂的活性结构，并加以体外培养构造出迷你组织？迷你组织有很多应用，诸如其细胞注射治疗更好的替代方案、药物筛选的理想器官模型、实验室内研究组织发育的工具等。由于水凝胶是典型软材料，高精度制造一直是业界难点，此外多细胞在微小的空间内的高效操纵更是一个挑战。受限于现有制造工艺的分辨率以及三维成型能力，想要在有限的微尺寸中重建人体组织异质微结构目前仍缺乏有效方法。经过近三年的研究，本课题组发明了一种在微球内打印活性结构，构造迷你组织的生物3D打印方法，能在微球内制造出螺旋面、玫瑰花、太极等复杂三维结构。基于本方法，我们在骨髓间充质干细胞微球中打印出内皮螺旋结构，建立了带螺旋形血管的成骨类器官，为体外重建复杂类器官提供了新的思路。

人造组织/器官对于研究人体组织发展和病变以及器官移植具有十分重要的研究意义。如今，随着人体类器官在体外模型中得到越来越广泛的应用，实验人员对模型的空间异质性以及结构功能性提出了越来越高的要求。异质凝胶微球的出现为这项研究提供了新的技术路线。异质凝胶微球在多组分、形态可控、使用方便等方面具有独特的优势，目前已经在组织工程、药物释放、生物探针以及再生医学等科学领域取得了重要发展，并演化出了核壳结构、多组分分区结构等各种形态。但已有的制造工艺无法可控制造出具有高成型分辨率、三维分布可控的异质凝胶微球，也就无法重建复杂的体外人体组织。

课题组提出了一种基于微喷头的异质螺旋凝胶微球的三维打印工艺，首次实现了诸如球面螺旋、太极图案、玫瑰花图案等复杂形态，并大大提高了细胞组分凝胶在微球内的打印精度，实现了单细胞螺旋线排列。该方法采用基于多通道微流控芯片的微喷头，将含有不同细胞组分的水凝胶通过精确注射产生比例可调的分区形凝胶液滴；同时通过位于喷头底部的气流喷头产生可控气流使液滴产生旋转，使细胞在液滴内部按照螺旋结构排列。打印过程实现了多组分的比例调节以及气流喷头位置的在线监测，分辨率高。和现有制造方法相比，其最大的特点是首次实现了三维结构的可控成型，并将成型精度提高到了单细胞分辨率。

人体组织具有多尺度的结构异质性，比较典型的为具有复杂形貌和功能的血管化组织。在传统研究中，为了实现该类型组织的构建，通常采用组织支架进行细胞培养。然而由于其细胞分布以及结构形貌具有高度的自发性和随机性，因此极大地限制了其应用。采用该研究提出的螺旋凝胶微球能够很方便地进行体外微三维组织构建。该团队采用同步包裹人体静脉内皮细胞（HUVECs）和人体骨髓间充质干细胞（HUMSCs）的方式实现了在螺旋凝胶微球内细胞共培养微环境的构建。所采用的内皮细胞呈球面螺旋结构分布在间充质干细胞周围，形象地模拟了人体骨组织微结构的生理特点。最后，在体外培养环境下分别实现了内皮细胞的血管化以及间充质干细胞的成骨化，初步实现了体外骨组织类器官的功能化构建。该研究在复杂三维共培养、再生医学、组织工程等领域具有重要的意义。

图 1. 气流辅助异质螺旋微球类器官的成型工艺

图 2. 小鼠成纤维细胞(L929)在螺旋凝胶微球内的包裹和增殖

图 3.基于人体内皮细胞和骨髓间充质干细胞的共培养模型实现体外类器官的制造

图 4. 基于该方法制造的螺旋异质凝胶微球

目前该成果已在WILLY旗下的SMALL期刊发表，被选为封底论文，通讯作者为浙江大学机械工程学院的贺永教授、机械工程学院的傅建中教授、基础医学院的欧阳宏伟教授。Airflow‐Assisted 3D Bioprinting of Human Heterogeneous Microspheroidal Organoids with Microfluidic Nozzle[J]. Small, 2018: 1802630.