用于纳米孔检测的光流控平台，实现动物体液中病毒RNA的无标记定量检测

在过去几十年，全球经历了多次严重的病毒大流行，如2009年的猪流感病毒、2013-2016年的埃博拉病毒、2015-2016年的寨卡病毒以及2019年末开始的COVID-19病毒等。这些疫情导致了大量人员失去生命，造成重大的经济和社会损失。目前，可用的大多数病毒检测方法大多靶向特定的病毒核酸和蛋白质生物标志物。然而，这些方法要么需要复杂的PCR操作，要么就是灵敏度和可靠性较差。

近期，美国加州大学（University of California）的Holger Schmidt教授，杨百翰大学（Brigham Young University）的Aaron R. Hawkins教授和得克萨斯生物医学研究所（Texas Biomedical Research Institute）的Jean L. Patterson教授在期刊Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America上联合发表了一篇题为“Label-free and amplification-free viral RNA quantification from primate biofluids using a trapping-assisted optofluidic nanopore platform”的工作，报告了一种集成的光流控纳米孔平台，用于对各种生物样品液体中病毒的RNA载量进行无标记和无扩增的定量测定。

先前，该团队报道过一种用于纳米孔检测的光流控方法，即借助捕获区域辅助提高捕获率的技术（trapping-assisted capture rate enhancement，TACRE），并将其应用于合成低聚物和鼻拭子样本中的SARS-CoV-2 RNA。该方法是基于将核酸靶标固相提取到微珠上用于确保检测的特异性，然后这些微珠被光捕获至纳米孔的电捕获半径内，在那里靶标可被热释放并快速连续地通过纳米孔易位。在本工作中，该团队报告了这一技术概念作为临床诊断工具的验证，对灵长类动物模型中的病毒——寨卡病毒和SARS-CoV-2进行研究。

首先，研究人员构建了如图1所示的纳米孔集成光流控平台和实验装置。20 nm直径的纳米孔隙位于凸起上方的氧化膜中（T4时间点附近），Ag/AgCl电极在纳米孔②和出口③之间产生电势差，膜片钳电流放大器与电极连接，以测量纳米孔上的离子电流信号。与先前的TACRE工艺不同的是，本工作设计将磁珠推入凸起中，阻止磁珠暴露在流体流动中，减小磁珠上所释放的靶标被冲走的可能性，从而进一步降低检测的LOD。如图所示，理论上将携带靶标的微珠递送至纳米孔的过程可分为四个不同的时间点（T1-T4），在此期间，微珠将受到各种力的组合作用，如Ff（流体流动力），Fg（梯度力）和Fs（散射力，作用于光传播的方向）。可以看到，当散射力超过流体流动力时，珠子将被推入凸起。在凸起内部，仅Fs发挥作用，这促进了磁珠被有效地光捕获在纳米孔附近。随后，通过热释效应，靶分子便能迅速被纳米孔检测。

图1 纳米孔集成光流体平台及其工作原理示意图。

随后，该团队构建了基于磁珠的固相提取方法来从复杂的生物流体中（全血、尿液、精液）提取特定的病毒RNA。该固相萃取过程首先是通过基于链霉亲和素-生物素的附着过程，将磁珠表面修饰上具有标靶特异性的下拉序列。然后，将已知数量的功能化微珠与RNA样品混合，直到珠子上收集了所有靶标。后续，这些磁珠的一部分将会被光学捕获在纳米孔附近，其表面的靶RNA会被热释放进而检测。为了定量病毒RNA的浓度，该团队根据每个微珠上附着的病毒RNA估计数量、生物流体中RNA数量、与RNA样品混合的珠子总数等，估算出根据TACRE方法得到的病毒RNA浓度的计算公式。

图2 生物流体裂解和RNA提取流程示意图。

图3A展示了当空磁珠（无靶标）被光学捕获并在加热后的纳米孔电流信号，结果显示无假阳性信号。接着，该团队以狨猴精液样本为例进行了TACRE测定，并以PCR的结果作为独立参考。在光学捕获阶段，4个携带靶标的磁珠被捕获在纳米孔附近，热释放后，纳米孔采集到的特征易位信号如图3B所示，最终共有2620个易位信号被观察到。计算得到的病毒浓度，与qPCR的参考值相近。

图3 利用寨卡病毒感染狨猴的精液样本进行的捕获率提高实验结果。样本是在接种后第 9 天采集的。

最后，该团队将该检测方案应用于寨卡病毒和SARS-CoV-2的综合纵向研究，以跟踪四周内多个生物体液样本感染过程中的病毒载量。通过比较三种样品的纳米孔测量结果和qPCR结果发现，纳米孔测得的值与qPCR参考值具有良好的一致性，且纳米孔传感器所获得的病毒浓度值始终高于qPCR的结果。而这可能是因为无需逆转录、扩增等可能丢失靶标的操作。

图4 利用光流控纳米孔平台进行的临床生物流体纵向TACRE研究。

综上所述，研究人员展示了一种集成的光流控纳米孔平台，用于临床生物流体样本中病毒RNA的无标记和无扩增定量检测。采用优化后的固相提取方法，研究人员将病毒的RNA固定于微珠表面，从而简化并增强了目标分离的选择性。利用光学捕获系统，微珠被精准递送到纳米孔传感器旁，并通过热激活手段迅速释放目标颗粒。这一过程将局部目标颗粒的浓度大幅提升至100万倍以上，极大地加速了诊断速度，并且支持高通量检测。

论文链接：

https://doi.org/10.1073/pnas.2400203121

审核编辑：刘清